不同稀释液配方和冷冻保护剂对贵州黑山羊精液品质的影响

谭晓山，周 迪，李 平，李 俊，杨 蓉，陈光候，王 燕，陈大芳，龙清孟

(贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 550018)

山羊冷冻精液人工授精技术不仅可以减少本交带来的疫病传播风险，还能减少种公羊的饲养数量，减少饲养成本及引种成本，同时提高优秀种公羊的利用率和资源共享率，解决种羊场之间在地域及使用时间上的限制，具有良好的社会经济效益。山羊冷冻精液生产的关键在于稀释液配方及冷冻保护剂。本试验通过比较4种常用的山羊冷冻精液稀释液配方和2种冷冻保护剂对贵州黑山羊精液品质的影响，筛选出适合贵州黑山羊冷冻精液的稀释液和冷冻保护剂。

1 材料与方法

1.1 试验动物选择体况良好、无繁殖疾病的2～4岁贵州黑山羊种公羊3～5只作为试验动物。

1.2 试验时间与地点2018年6月在贵州省册亨县冗渡镇冗坪肉羊育种与繁殖工程中心及规模化健康高效养殖示范基地进行。

1.3 主要试剂TALP稀释液、葡萄糖、果糖、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、青霉素、链霉素、考马斯亮蓝、乙二醇、甘油。

1.4 主要仪器全自动精液质量分析系统(德国Minitube AndroVision)、移液器(Eppendorf L23114F)、正置显微镜(奥林巴斯CX41)、水浴锅(HH.S21-4)、17 ℃恒温箱(FYL-YS-150L)、超声波细管封口机、手提式车载运输箱(FYL-YS-50L)、高压灭菌锅(LMQ.C-100E)。

1.5 山羊冷冻精液稀释液配方根据国内对山羊冷冻精液稀释液配方的研究，选择4种较理想的配方分为4组，各组选择2种不同冷冻保护剂(见表1)。

表1 山羊冻精稀释液配方及分组

1.6 TALP稀释液配方 配制TALP稀释液100 mL：NaCl 654.5 mg，KCl 20 mg，MgCl2·6H2O 10 mg，NaH2PO46.2 mg，NaHCO3210 mg，葡萄糖250 mg，丙酮酸11 mg，乳酸钠112 mg，HEPES 120 mg。高压灭菌，使用前加入BSA 6 mg/mL，卡那霉素 7.5 mg/mL，pH值调至7.6[5]。

1.7 方法

1.7.1 采精于上午11：00左右，气温22 ℃以上，通过人工采精方法采集贵州黑山羊精液，并立即进行精子活力初步检测，将精液移至1.5 mL试管内，用棉花覆盖包裹进行保温，以减少对精子的刺激，置于17 ℃样品运输箱(车载冰箱)中保存带回实验室。

1.7.2 精液检测检测前先将全自动精液质量分析系统打开，载物台及载玻片等预热至37 ℃。将精液用0.9%生理盐水按照1∶9比例进行稀释后用全自动精液质量分析系统检测相关指标。

1.7.3 冷冻精液制作方法

1.7.3.11组(1-1、1-2)与3组(3-1、3-2)按方法1：(1)将精液与 Ⅰ 液按1∶2等温稀释(34 ℃)，用12～15层纱布包裹贮精瓶，连同 Ⅱ 液一起放入2～5 ℃冰箱中平衡1.5～2 h。(2)平衡后的精液用 Ⅱ 液等倍稀释，并装入0.25 mL细管后再平衡0.5～1 h。 (3)将液氮倒入完好的泡沫盒中，将细管架浸入液氮中预冷至液氮停止沸腾时提取细管架，固定于离液氮面2～3 mm的位置，将细管平放于细管架上熏蒸2～3 min后浸入液氮中保存。(4)42 ℃水浴解冻10 s后进行检测。

1.7.3.22组(2-1、2-2)按方法2：(1)在原精中加入3～4倍的Ⅰ液，1 200 r/min离心10 min，去掉上清液后加入Ⅰ液至原精的量。(2)将精液与Ⅰ液按1∶2等温稀释(34 ℃)，用12～15层纱布包裹贮精瓶，连同Ⅱ液一起放入2～5 ℃冰箱中平衡1.5～2 h。(3)平衡后的精液用Ⅱ液等倍稀释，并装入0.25 mL细管后再平衡0.5～1 h。(4)将液氮倒入完好的泡沫盒中，将细管架浸入液氮中预冷至液氮停止沸腾时提取细管架，固定于离液氮面2～3 mm的位置，将细管平放于细管架上熏蒸2～3 min后浸入液氮中保存。(5)42 ℃水浴解冻10 s后进行检测。

1.7.3.34组(4-1、4-2)按方法3：(1)将精液与TALP稀释液等量混合，离心洗涤3次，每次1 000～1 500 r/min，共5 min。(2)离心后的精液用Ⅰ液按1∶2等温稀释(34 ℃)，用12～15层纱布包裹贮精瓶，连同Ⅱ液一起放入2～5 ℃冰箱中平衡1.5～2 h。(3)平衡后的精液用Ⅱ液等倍稀释，并装入0.25 mL细管后再平衡0.5～1 h。(4)将液氮倒入完好的泡沫盒中，将细管架浸入液氮中预冷至液氮停止沸腾时提取细管架，固定于离液氮面2～3 mm的位置，将细管平放于细管架上熏蒸2～3 min后浸入液氮中保存。(5)42 ℃水浴解冻10 s后进行检测。

2 结果与分析

2.1 精液质量利用全自动精液质量分析系统对4只贵州黑山羊种羊精液进行检测，由表2可见：耳号为N7003的羊精子总体活力、向前移动活力、快速前进活力均最高，分别为91.41、59.69、47.60。其次是N7182号，分别为85.53、57.74、40.10。因此选择这2只种羊的精液制作冷冻精液。

表2 贵州黑山羊原精液质量检测

2.2 不同稀释液配方对冷冻精液质量的影响由表3可见：(1)添加乙二醇保护剂的4组中，总体活力最高的是3-1组(67.06±10.10)，其次为1-1组(58.85±5.73)，2个组之间差异不显著，均显著高于2-1组与4-1组；前进式活力最高的是1-1组(17.22±0.34)，除与3-1组之间差异不显著外，均显著高于2-1组、4-1组；4个组的精子畸形率均高于20%，最高的为3-1组(29.06±16.11)。(2)添加甘油保护剂的4组中，总体活力最高的是3-2组(56.95±7.83)，前进式活力最高的是1-2组(22.73±6.25)，结果与添加乙二醇保护剂的一致；精子畸形率最高的是2-2组(27.37±6.59)，最低的是4-2组(15.35±4.69)，但4-2组精子活力最低。(3)除2-1组外，添加乙二醇保护剂的1-1、3-1、4-1组的精子总体活力均要高于相对应的添加甘油的1-2、2-2、4-2组，而精子畸形率则相反；同时，添加甘油保护剂的1-2、2-2、3-2组精子前进式活力均要高于相对应的添加乙二醇的1-1、2-1、3-1组，最高为1-2组(22.73±6.25)。

表3 不同稀释液配方的精子质量检测 %

3 讨论

3.1添加2种不同冷冻保护剂的4种稀释液配方对贵州黑山羊冷冻精液的影响不一，总体上是使用乙二醇保护剂的精子总体活力和畸形率高于甘油保护剂，但精子的前进式活力低于甘油保护剂。虽然人工授精通常为深部输精，但仍然需要精子向前移动的能力，所以甘油作为冷冻保护剂的效果要高于乙二醇。这也与他人对内蒙古绒山羊冻精的研究结果一致[6]。因此，在贵州黑山羊冻精生产过程中建议选择配方1或配方3作为稀释液配方，甘油作为冷冻保护剂。

3.24种配方的冷冻精液精子畸形率大部分都高于20%，不符合国家标准《山羊冷冻精液》(GB 20557—2006)的要求，有可能是在推片过程中操作不当所致。

4 结论

综合评价，在贵州黑山羊冻精生产过程中可选择配方1或配方3作为冷冻精液稀释液配方，甘油作为冷冻保护剂。