分光光度法测定饲料添加剂叶酸含量的方法研究

霍艳杰，雷浩，高勤叶，曹晓洁，张晓英，贺习文

（陕西秦云农产品检验检测股份有限公司，渭南714000）

叶酸一种水溶性B族维生素，是动物机体必需的一种维生素，是脂肪代谢不可或缺的辅酶，对氨基酸代谢和蛋白质、核酸的生物合成有重要影响[1]。在动物机体中，叶酸缺乏会引起巨幼红细胞贫血、同型半胱氨酸代谢障碍，在一些已有报道中，向动物食粮中添加叶酸，能改善畜禽动物的生长性能和免疫机能，同时在治疗炎症方面有较好的效果[2]。

目前已有报道的用来检测叶酸的方法有液相色谱-串联质谱法[3,4]、高效液相色谱法[5-8]、微生物法[9-11]、氨基酸分析仪法[12,13],、荧光猝灭法[14,15]、紫外分光光度法[16]等。但这些方法均用于水果、乳粉、血浆、叶酸片等基质，鲜有用于饲料添加剂叶酸的分光光度法。本研究采用简单、快捷的分光光度法测定饲料添加剂叶酸的主成分含量，该方法稳定性好，实用性强，值得推广。

1 试验部分

1.1 仪器及试剂

SP-756P型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；CP224C型万分之一天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）；KQ-100DB型数控超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）；PHSJ-4F型pH计（上海仪电科学股份有限公司）。

叶酸标准品（上海源叶生物科技有限公司，纯度99%）；无水碳酸钠（天津市致远化学试剂有限公司，分析纯）；磷酸二氢钾（天津市天新精细化工开发中心，分析纯）；超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司，一级水）；氢氧化钠（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL；磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾6.8g,加500mL水使溶解，用0.1moL/L的氢氧化钠调节pH至6.8，用水定容至1000mL；2 mol/L碳酸钠溶液：称取106g无水碳酸钠，用水溶解定容至500mL；0.1 mol/L碳酸钠溶液：称取10.6 g碳酸钠，用水溶解定容至1000 mL；叶酸标准储备液：称取0.1 g（精确至0.0001g）叶酸标准品于100mL棕色容量品中，加0.1mol/L碳酸钠溶液，超声溶解并定容至刻度，摇匀，叶酸含量为1000μg/mL；叶酸标准工作液：准确移取10mL叶酸标准储备液于50mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L碳酸钠溶液稀释定容，浓度为200μg/mL。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理过程

准确称取试样0.1g（精确至0.0001g），置于100mL棕色容量瓶中，加0.1mol/L碳酸钠溶液约80mL，超声至完全溶解后，用0.1mol/L碳酸钠溶液定容至刻度，摇匀。

1.2.2 标准溶液的配制

叶酸标准储备液：称取0.1g（精确至0.00001g）叶酸标准品于100mL棕色容量品中，加0.1mol/L碳酸钠溶液，超声溶解并定容至刻度，摇匀。叶酸含量为1000μg/mL，置于2℃～8℃环境保存；

叶酸标准工作液：准确移取10mL叶酸标准储备液于50mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L碳酸钠溶液稀释定容，浓度为200μg/mL。

1.2.3 样品测定

准确吸取样品处理液5.00 mL于50mL棕色容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。准确吸取样品稀释液1.00mL于50mL棕色容量瓶中，用磷酸盐缓冲液定容至刻度,用1cm石英比色皿在波长281nm处用分光光度计测定各溶液吸光度。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线及相关系数

准确移取1.2.2中叶酸标准工作液0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于50mL棕色容量瓶中（相当于10μg、20μg、40μg、80μg、160μg、200μg、300μg、400μg），用磷酸盐缓冲液定容至刻度，以磷酸盐缓冲液为参比，用1cm石英比色皿在波长281nm处用分光光度计测定各溶液吸光度，以叶酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线，见图1。

图1 叶酸系列标准工作曲线

从图1可以看出，叶酸标准工作曲线在10~400μg范围内线性良好，线性方程为y=0.0013x+0.0013，相关系数R2=1.0000，满足试验条件。

2.2 精密度考察

按照1.2中的样品前处理方法及样品测定过程，准确称取已知含量的叶酸添加剂质控样品0.1g，并进行6组平行试验，并按照相同方法连续测定3d，所测得数据见表1。

从表1可以看出，6组平行样品日内变异系数为0.7%，日间变异系数为0.9%，证明本研究精密度良好。

表1 方法精密度测试 单位：%

2.3 回收率考察

按照1.2中的样品前处理方法及样品测定过程，已知叶酸含量的叶酸添加剂质控样品，标识值为96.4%，本方法测定结果为96.3%，回收率为99.9%，证明本研究回收效果良好。

2.4 缓冲溶液稳定效果考察

将处理好的样品溶液分别静置10min、20min、30min、40min、50min、60min后测定其结果，测定结果表明静置时间≤40min时测定结果相对稳定。静置时间≥50min时，测定结果较之前测定结果有较大变化，证明叶酸在磷酸盐缓冲溶液中40min内相对稳定。

2.5 实际样品测定

国标方法测定饲料添加剂叶酸含量用的是液相色谱法，需要液相色谱仪，试验过程耗时较长，成本较高，适用于大型生产厂家检测，本研究方法方便快捷，耗时相对较短，检测结果准确，还可以减小成本，实用性强。

从市场上购买和抽取了6份叶酸添加剂样品，采用国标方法和1.2中的样品前处理方法及样品测定过程同时对样品中叶酸含量进行测定，测定的部分结果见表2。

表2 实际样品的测定情况 单位：%

从表2可以看出，用两种方法分别测定饲料添加剂叶酸含量，最大标准偏差≤0.3%，证明本研究结果准确可靠。

3 结论

本研究基于天津药学中紫外分光光度法测定叶酸片含量的测定，建立了一种测定饲料添加剂叶酸含量测定方法。经过试验证明，本方法具有良好的稳定性，且方法简单、快速、准确。