猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用

张记宇，韩郁茹，时洪艳，陈建飞，张 鑫，刘建波，张燎原，冯书风，冯廷帅，季朝阳，石 达，冯 力

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室猪消化道传染病创新团队， 哈尔滨 150069)

猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)是2017年在中国广东省首次发现的一种可引起仔猪感染并发病的重要病原体[1]，感染的仔猪表现为呕吐，腹泻，脱水直至死亡。5日龄以下的仔猪死亡率高达90%，育肥猪症状轻微，只引起轻度腹泻，在感染后2 d可恢复健康。组织病理学分析，感染仔猪表现为空肠和回肠明显的病变，肠绒毛萎缩变短，十二指肠切片仅显示轻微的病理变化[2]。SADS-CoV的基因序列与猪场附近洞穴内发现的蝙蝠冠状病毒(HKU2-CoV)相似率高达90%以上，暗示SADS-CoV可能由蝙蝠跨种传播给猪[1]。SADS-CoV感染仔猪的临床症状与PEDV、TGEV、PDCoV感染相似，目前，只能通过实验室检测方法进行鉴别诊断。因此，迫切需要建立一种灵敏可靠的诊断方法鉴定SADS-CoV感染。常规PCR虽然操作简单，但灵敏度不高。逆转录环介导恒温扩增技术(RT-LAMP)可以实现对SADS-CoV的检测，但不能用于定量分析样本中病毒拷贝数[3]。荧光定量PCR技术发展迅速，具有精确度高、灵敏性强、重复性好的优点[4-5]，目前已广泛应用于各种动物和人类病原的检测。本研究以SADS-CoV高度保守的N基因序列作为靶标，建立SADS-CoV荧光定量PCR检测方法，并对感染的细胞和攻毒仔猪的临床样品进行检测，为SADS-CoV流行病学调查和基础研究提供可靠快捷的技术。

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞

SADS-CoV由华南农业大学马静云教授惠赠，PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV均由本实验室分离鉴定并保存。……