产甘油假丝酵母启动子优化

杨海雁，于喆源

（张掖市质量检验检测研究院，甘肃张掖 734000）

甘油是一种重要的轻化工原料，具有吸湿性强、粘度高、冰点低等特点[1-2]。据报道，甘油作为原料有2 000多种用途，应用于十多个行业，其中在食品工业中通常作乳化剂、甜味添加剂、保湿物质等，在医药工业中用于溶剂和润滑剂，在国防工业中用以制备硝化甘油、生产炸药或添加到燃料中作为抗冻剂[3-4]。按生产方式不同，甘油主要分为天然甘油、化学合成甘油、微生物发酵甘油3种。近年来研究发现，在特定的培养条件下，许多微生物，包括细菌、酵母、霉菌、原生动物和藻类等均能合成甘油[5-6]，其中利用耐高渗透压酵母发酵生产甘油的方法研究较为广泛。该方法的主要特点是酵母可在较高糖浓度及有氧条件下生长发酵，不需要加入转向剂，糖的转化率可高达60%[7-8]。本文通过优化产甘油丝酵母的启动子，使得产甘油假丝酵母更加高效的表达，从而增加甘油的产量，产生更大的经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌JM109、产甘油假丝酵母WL2002-5，由本实验室保存；Tryptone、Yeast Extract，购自Oxoid公司；YPD培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；T-Vector pMD19（simple）、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶，购自大连Takara公司。

1.2 仪器与设备

MJ Mini型PCR仪，美国伯乐（Bio-Rad）公司；HITACHICR22G型低温高速离心机，日本HITACHI公司；Electroporator 2510型电转仪，德国Eppendorf公司；GelDoc-It310型UVP凝胶成像仪，英国UVP有限公司；DYCZ-40D型琼脂糖凝胶水平电泳仪，北京六一厂；BK-FL型荧光显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计

根据pCAMBIA1302质粒中GFP编码基因设计引物STL1、STL2，为了利于将PCR片段连接到质粒pGAPZB上，在上游引物STL2的5’端添加EcoRⅠ酶切位点，在下游引物STL2的5’端添加SacⅡ酶切位点[9-11]；……