美洲型与欧洲型PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立

高 雅，武欣欣，蒋小玲，贺晓霜，肖 兴*，周双海*

(1. 北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206；2. 衡阳市畜牧水产事务中心，湖南 衡阳 421001)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一种基因组大小约为15 kb的具有囊膜的RNA病毒，现有两种血清型，即美洲型和欧洲型，两者不仅在形态与理化方面相似，在致病性方面也基本相似，都引起同一种疾病，即猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，这是一种以母猪出现早产、流产、死产、产出木乃伊胎等繁殖障碍、仔猪与育成猪出现呼吸系统症状和较高病死率的危害很大的主要传染病[1, 2]。但是，二者在全基因组核苷酸序列同源性方面仅为80%左右，显示出很大差异[3, 4]。中国于1996年首次分离到PRRSV美洲型毒株[5]，在2010年首次分离鉴定出PRRSV欧洲型毒株[6]。PRRSV流行毒株在临床上的多样性给疫病的诊断和防控带来了很大困难。现阶段，病毒基因分型检测主要使用RT-PCR技术，为了提高检测时效而多采用多重RT-PCR方法。国内已有少量研究者建立了关于PRRSV美洲型与欧洲型毒株多重RT-PCR检测方法，但其最低检测都超过103copies/μL[7, 8]，这些方法的敏感性明显不够高，在应用于临床检测时会导致不少假阴性结果。因此，本研究目的是建立一种具有高敏感性的针对美洲型和欧洲型PRRSV的双重RT-PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸模板

美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV和猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒核酸模板由北京农学院动物疫病研究室保存。

1.2 病毒重组质粒模板的构建

比对分析PRRSV美洲型毒株、欧洲型毒株的基……