西太平洋多金属结核区表层沉积物细菌群落结构及其对沉积扰动的响应

王苑如，崔鸿鹏，李继东，孙 栋，王春生，杨 娟*

(1.中国地质大学(北京) 海洋学院，北京 100083；2.自然资源部 第二海洋研究所，浙江 杭州 310012;3.自然资源部 海洋生态系统动力学重点实验室，浙江 杭州 310012)

0 引言

深海因其独特的环境条件，使得生存在内的微生物具有数量庞大、分布广泛、种类繁多和代谢功能多样的特点[1]。不同深海生境(如热液口、冷泉、多金属结核区和海山区等)的微生物群落存在显著差异[2]，它们不仅参与海洋地球化学元素循环[3]，同时也参与深海矿产资源的形成[4-6]。对不同深海生境微生物群落研究有利于认识多样的生态系统以及发生在海水-沉积物界面丰富的生命过程。随着大洋钻探计划(ODP)等多航次的进行，对太平洋边缘海及盆地沉积物中的细菌群落已逐步展开调查和研究[7-9]。

深海沉积环境不仅具有低温、高压等特点，还含有复杂和独特的化学成分，如腐殖酸、重金属等，较难获得高质量的深海沉积物DNA[10]。近年来，16S rRNA基因测序技术迅速发展[11]，特别是高通量测序技术开始广泛地应用于深海环境微生物检测中，可对环境样品的数百万个DNA分子同时测序，从而反映环境中目标生物组成的全貌[12]。

目前，关于多金属结核区微生物群落结构的研究多集中在东太平洋CCFZ(Clarion-Clipperton Fracture Zone)结核区[13-16]。研究表明，除了海底地形地貌、洋流、氧化还原条件等因素外[17-18]，火山、地震等地质活动对深海沉积环境的扰动作用，也会对微生物的多样性和群落结构产生深远影响[19-21]。

本文研究区位于热带西太平洋海区马尔库斯-威克海山群内，在海山上常发育丰富的富钴结壳，在深海盆地表层沉积物中则富含铁锰多金属结核。本研究采集了结核区表层沉积物样品，采用高通量测序技术分析细菌群落结构及功能群组成，并结合粒度讨论细菌群落对沉积环境变化的响应。研究结果可以丰富深海结核区微生物资源调查成果，并为探索深海沉积环境微生物群落适应机制及地球化学循环功能等提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

沉积物样品由“大洋一号”科学考察船DY48航次于2018年8月13日至10月21日期间在马尔库斯-威克海山区通过箱式采样器采集。采样区范围为155°E—160°E，19°N—21°N，平均水深约为5 500 m(图1)，共6个站位(BC1817、BC1812、BC1803、BC1826、BC1833和BC1834)。每站取1个表层沉积物样(0～10 cm)装入50 mL无菌离心管，置于-20 ℃ 冰箱保存。同时，利用有机玻璃插管采集1根沉积物柱状样。

图1 西太平洋采样点位地理位置Fig.1 Location of sampling sites in the western Pacific Ocean

沉积物柱状样利用ORP仪(innoORP 100，Twinno)分层测定氧化还原电位(Eh)，现场测定完毕后将沉积物分层。0～5 cm，每隔1 cm为1层；5～ 11 cm，每隔2 cm为1层；11 cm之下，每隔3 cm为1层。分层样品装于自封袋置于-20 ℃冷箱保存，后期在实验室冷冻干燥，以备后续粒度及有机碳测定。

1.2 DNA提取和PCR扩增

在超净台中称取1份湿样品500 mg，采用土壤DNA抽提试剂盒FastDNA SPIN KIT for Soil(MpBio，Solana Beach，Calif. USA)提取沉积物DNA，操作依据试剂盒说明书进行。使用Nanodrop分光光度计(Nanodrop 2000，ThermoScientific，US)测定DNA浓度及纯度。

对样品进行16S rRNA基因PCR扩增实验，采用细菌V4可变区特异性引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。该反应体系为10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，模板DNA 1 μL，引物 338F 和806R各 1 μL，TaKaRaEx Taq(5U/μL) 0.5 μL，BSA 1 μL，最后用灭菌蒸馏水将体系补充至25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；72 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，95 ℃延伸30 s，72 ℃最后延伸10 min，27个循环。

1.3 16S rRNA产物纯化和高通量测序

扩增产物中加入5 μL 6x Loading Buffer，混合均匀后放入质量分数为1%的琼脂凝胶中，以105～120 V电压电泳10～20 min。将需要的DNA条带的凝胶切下放入称好质量的离心管中，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(USA)回收试剂盒对凝胶进行纯化回收。回收产物委托上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina MiSeq设备进行高通量测序。

1.4 细菌多样性分析

Miseq测序后去除嵌合体，进行优化质控，基于Silva132数据库(http：//www.arb-silva.de/)和Usearch(v7.1)软件，以相似度97%为阀值获得OTU(operational taxonomic units)物种注释和丰度信息。利用软件Mothur(v1.36)进行香农-威纳指数(Shannon-Weiner,H’)、辛普森指数(Simpson,1/D)、ACE指数(SACE)以及Chao1指数(Schao1)计算，并对细菌多样性进行评估。各指数计算公式参见文献[22-23]。

1.5 功能预测分析

将序列数小于1%的OTU剔除后，统计细菌在不同分类水平上的序列数量，用以分析研究区细菌群落结构和功能类群。

将获得的OTU物种注释和丰度信息在PICRUSt软件(http://picrust.github.io/picrust/)上进行标准化，剔除16S标记基因在物种基因组中的拷贝数目。根据基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信息，开展细菌功能预测分析，获得相似功能的集合分类(KEGG Orthology，KO)、代谢通路等信息，并根据OTU序列数量估算各功能类别的丰度。通过PICRUSt获得代谢通路3(KEGG pathway level 3)对应的功能信息，利用R语言的pheatmap包制作代谢通路3功能基因丰度热图[24-25]。

1.6 有机碳及粒度分析方法

利用元素分析仪测定柱状样分层样品的总有机碳(TOC)含量，预处理及测定方法参见文献[26-27]。

利用MasterSizer 2000粒度仪测定分层干样品粒度，预处理及测定方法依据文献[26]。

2 结果和分析

2.1 沉积环境特征

各站位的表层沉积环境特征如表1所示。

表1 箱式采样站位沉积环境特征Tab.1 Sedimentary features and description of the box corer sites

由表1可知，各站位水深均超过5 000 m。除BC1826站位外，其余各站位沉积物表层均有结核分布。沉积环境整体为氧化环境，北部站位的Eh较南部站位低；南部站位的TOC含量较北部站位高；各站位平均粒径均较小，其中BC1826站位的粒度相对较粗。

粒度组分三元图(图2)显示，本区大部分站位的沉积物以黏土、粉砂为主，粉砂含量略高于黏土含量，仅BC1826站砂含量较高，且变化较大。从粒度频率曲线(图3)可见，BC1826站底层(24～39 cm)的粒度组分单一，以细粒组分为主，集中在10 μm数量级，与其他站位相似，但在中部(5～24 cm)出现特殊的100 μm 粒径组分。

图2 粒度组分三元图Fig.2 Ternary diagram of particle size composition

图3 BC1826站位分层粒度频率曲线图Fig.3 Frequency curves of grain size distribution along the depth at BC1826 station(不同颜色曲线代表不同层位沉积物样品)(The curves with different colors denote different segments of sediments along depth)

2.2 细菌序列数与OTU 数量

研究区6个站位共获得253 012条序列，各站位不同分类单元的OTU数量如表2所示：门水平上为32～41个OTU，纲水平上为67～85个OTU，目水平上为153～195个OTU，科水平上为195～261个OTU，属水平上为243～322个OTU，种水平上为405～625个OTU。其中，BC1812站各个分类单元的OTU数量相对较多，而BC1826站的OTU数量最少。

表2 各站样品的序列数及各分类单元OTU 数量Tab.2 Number of sequences and OTUs from each sample

2.3 多样性指数

各站位细菌多样性指数对比(表3)发现，BC1817、BC1812和BC1803站位的H’，SACE，SChao1指数相对较高；BC1833和BC1834站次之；BC1826站位最低，与OTU数量变化基本一致。

表3 西太平洋马尔库斯-威克海山区表层沉积物细菌覆盖率与多样性Tab. 3 Evaluation of coverage and biodiversity of bacteria in deep-sea surface sediments from Marcus-Wake Sea Mountain area in the western Pacific Ocean

2.4 细菌群落结构

本研究共获得细菌41个门、85个纲、189个目、261个科和 322个属。其中，序列数量较高的为14个门，共占序列总数的96%。第一大类群为变形菌门(Proteobacteria)，占序列总数的51.46%，包括γ-、α-和δ-三大纲，占比分别为24.76%、20.21%和6.48%。第二大类群为绿弯菌门(Chloroflexi)，占序列总数的18.32%。此外，还有酸杆菌门(Acidobacteria)(6.29%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(4.51%)、浮霉菌门(Planctomycetes)(4.51%)、放线菌门(Actinobacteria)(3.66%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(2.38%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)(1.17%)、Dadabacteria门(1.04%)、Calditrichaeota门(0.71%)、Rokubacteria门(0.66%)、Patescibacteria门(0.63%)和一个未鉴定类群(0.60%)。剩余的27个门细菌的序列数总和占比不超过5%。

除BC1826 站外，其余5个站位的细菌组成相似，将5个站位的总序列数合并计算可得出，优势类群主要有α-变形菌纲(22.94%)、绿弯菌门Dehalococcoidia纲(16.27%)和γ-变形菌纲(15.58%)。BC1826站则以γ-变形菌纲占优势。

对序列数量大于1%的目(order)分类水平OTU数量进行统计，共获得23个目，包含6个优势科、10个优势属。其中，γ-变形菌纲有交替单胞菌目(Alteromonadales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、Steroidobacterales目和弧菌目(Vibrionales)；α-变形菌纲有红杆菌目(Rhodobacterales)、红螺菌目(Rhodospirillale)、红弧菌目(Rhodovibrionale)和鞘脂杆菌目(Sphingomonadales)；δ-变形菌纲有粘球菌目(Myxococcales)、NB1-j和SAR324；放线菌纲(Actinobacteria)有放线菌目(Actinomarinales)和棒状杆菌目(Corynebacteriales)；拟杆菌纲(Bacteroidia)有噬纤维菌目(Cytophagales)。各个类群占总序列数的比例如图4所示。

图4 西太平洋马尔库斯-威克海山区表层沉积物细菌目分布Fig.4 Distribution of bacterial order phylogenetic groups from Marcus-Wake Sea Mountain area in the western Pacific Ocean

棒状杆菌目、芽单胞菌目(Gemmatimonadales)、Phycisphaerales目、红杆菌目、红螺菌目、红弧菌目、Steroidobacterales目和粘球菌目下均仅含一个科或属，依次分别为红球菌属(Rhodococcus)、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、 Phycisphaeraceae科、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、Magnetospiraceae科、Kiloniellaceae科、Woeseia属和粘球菌科(Myxococcaceae)。鞘脂杆菌目中，鞘脂杆菌属(Sphingomonas)占75.4%；弧菌目中，弧菌属(Vibrio)占52.4%；伯克氏菌目(Burkholderiales)中，伯克氏菌科(Burkholderiace)青枯菌属(Ralstonia)占36.11%；假单胞菌目中，不动杆菌属(Acinetobacter)占94.5%；交替单胞菌目中，交替单胞菌属(Alteromonas)占68.17%、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)占17.41%、希瓦氏菌属(Shewanella)占8.95%、海杆菌属(Marinobacter)占3.30%。

图5显示，BC1826站的细菌群落结构与其他站位差异较大，仅检出9个目，而其他站位一般为18～19个目。其中，交替单胞菌目和弧菌目仅在BC1826站检出，分别占该站序列数的67.03%和4.17%。BC1803和BC1834站位的细菌群落组成和结构较为相似。假单胞菌目仅在BC1833站检出，占该站序列数的0.89%；Cytophagale目仅在BC1812和BC1817站位检出，分别占站位序列数的1.14% 和1.02%；鞘脂杆菌目仅在BC1817、BC1826和BC1833站位中检出，分别占站位序列数的 0.83%、1.11%和2.29%。

图5 西太平洋马尔库斯-威克海山区 6个站位表层沉积物细菌目水平分布Fig.5 Distribution of bacterial order phylogenetic groups of six different surface sediments from Marcus-Wake Sea Mountain area in the western Pacific Ocean

2.5 细菌群落功能预测分析

图6展示了细菌在KEGG pathway level 3上丰度最高的20个代谢通路信息。与群落多样性结果相似，BC1812、BC1833和BC1817站，BC1834和BC1803站的功能谱相对丰度相近，而BC1826站与它们差异较大。除双组分系统功能基因外，BC1826站大部分功能基因丰度都较其他站位低。

图6 PICRUSt预测的KEGG第三等级分布图Fig.6 Relative abundances of PICRUSt predicted genes relevant with KEGG pathway level 3 across the site(图标为数据均一化结果，无单位，数值越大表示该站位与此代谢途径相关性越高。)(The icon shows that the data homogenization result has no unit. The larger the value, the higher the correlation between the site and this metabolic pathway.)

3 讨论

3.1 东、西太平洋多金属结核区细菌群落结构差异

海底多金属结核区多分布于热带太平洋水深超过4 000 m的海底，除高压、低温、黑暗外还富含铁、锰、铜、锌、镍等金属资源，是区别于其他大洋海底的特殊生境[2]。研究区位于西太平洋的马尔库斯-威克海山区(以下简称西区)，富含铁锰结核。区内6个表层沉积物样品的细菌群落结构分析结果表明，除BC1826站位外，细菌群落类群组成相似，空间异质性较低，以γ-(24.76%)和α-(20.21%)变形菌纲为优势种群。

为进一步了解太平洋结核区微生物群落的结构特点及空间分布规律，利用现有的文献资料，对东、西太平洋结核区细菌群落调查结果进行了汇总整理(表4)。对比发现，东太平洋结核区(以下简称东区，位置见图1)，表层沉积物细菌群落结构变化较大(表4)，其中γ-变形菌纲占比为9.74%～50.4%，α-变形菌纲占比为9.06%～18%[14,16,28-30]。这可能与东区自东向西温跃层由浅变深，初级生产力和叶绿素a由高到低，有机质沉降由高到低等环境梯度变化相关[31]。此外，不同的分析手段也可能是东区细菌群落结构调查结果差异较大的原因之一。

表4 太平洋多金属结核区不同站位细菌群落概况Tab.4 Survey of bacterial communities in different sites of polymetallic nodule areas in the Pacific Ocean

太平洋结核区沉积物中总体细菌门类丰富，东、西两区共有的细菌门类包括变形菌门(α-、γ-、δ-纲)、浮霉菌门、酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和硝化螺旋菌门等；共有的优势属包括假交替单胞菌属、希瓦氏菌属、海杆菌属、不动杆菌属和鞘脂杆菌属。其中，变形菌、浮霉菌和放线菌多数类群具有嗜冷和嗜压生理机制，是深海中常见的类群[32]。

此外，东、西太平洋结核区沉积物中部分细菌类群组成存在一定差异[14,16,29]：如西区γ-变形菌占比(24.76%)比东区(26.09%)低；厚壁菌门(Firmicutes)在东区局部站位占比高达49.06%，而在西区未检出；绿弯菌门在西区的占比(7.4%～18.32%)要远高于东区(1.97%～3.75%)；Elusimicrobia门、Hydrogenedents门、Ignavibacteriae门、芽孢杆菌纲(Bacilli)仅在东太平洋结核区检出；Dadabacteria门、Calditrichaeota门、Rokubacteria门和Patescibacteria门仅在西太平洋结核区检出。

3.2 细菌功能类群

深海结核区存在丰富的铁锰元素，因此沉积物中多具有抗金属活性或代谢金属的微生物，这些铁锰细菌可能直接或者间接地影响海水-沉积物界面多种金属元素的分布[33]。本研究区铁锰氧化还原细菌占比为10.20%，其中主要为交替单胞菌属和假交替单胞菌属，分别占6.90%和1.80%。深海假交替单胞菌属的不产色素菌株可通过增强营养获取在营养竞争中获得优势[34]，并通过构建细胞外基质以诱导或控制矿化作用。与铁锰还原反应相关的希瓦氏菌属及具有一定金属适应性的海杆菌属和不动杆菌属[35]在本研究区也占比较高，丰度分别达到1.00%，0.30% 和0.20%。假单胞菌目的假单胞菌属(Pseudomonas)多为可培养的锰氧化细菌，但许多菌株如PseudomonasputidaMnB1和GB-1[36]，在本区未检出。另一些在东太平洋结核区发现的二价锰氧化菌属如芽孢杆菌(Bacillus)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、土微菌属(Pedomicrobium)、纤发菌属(Leptothrix)和噬纤维菌属(Cytophaga)以及属于锰还原菌的地杆菌属(Geobacter)、芽孢杆菌属(Bacillius)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和除硫单胞菌目(Desulfuromonadales)[30]也未在本研究区内发现。

除铁锰细菌外，一些与硫元素循环相关的红杆菌目红杆菌科(0.73%)、红螺菌目Magnetospiraceae科(3.49%)以及红弧菌目Kiloniellaceae科(5.39%)在本区样品中检出。其中，红杆菌科是海洋或者高盐环境中专有的类群，此科大多数属为异养型硫氧化细菌，具有重要的无机硫和有机硫化合物转化能力[37-38]；红螺菌目的Magnetospiraceae科主要以硫代硫酸盐为电子供体进行自养代谢。硫酸盐还原菌参与海洋沉积物物质循环的重要过程，已发现的硫酸盐还原菌大多为厌氧菌种，大部分属于δ-变形菌纲，少数属于厚壁菌门[39]。在西太平洋结核区的δ-变形菌纲(6.48%)中未发现硫酸盐还原菌，表明区内的硫酸盐还原反应相对不活跃；而东太平洋结核区发现了以脱硫细菌目(Desulfobacterales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)以及互营杆菌目(Syntrophobacterales)为主的硫酸盐还原菌类群[30]。

本区参与氮循环相关的类群主要为硝化螺旋菌门(1.17%)。细菌参与硝化作用有利于补充沉积物表层的NO3-含量[40]。

PICRUSt功能预测表明研究区细菌群落功能基因以氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids)、碳代谢(Carbon metabolism)、ABC转运蛋白(ABC transporters)、双组分系统(Two-component system)、核糖体(Ribosome)、群体感应(Quorum sensing)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、嘌呤代谢(Purine metabolism)、嘧啶代谢(Pyrimidine metabolism)功能占主导，此外，也存在原核生物碳固定途径(Carbon fixation pathways in prokaryotes)、乙醛酸和二羧酸代谢(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、氨酰基-tRNA生物合成( Aminoacyl-tRNA biosynthesis)、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(Glycine, serine and threonine metabolism)等较为重要的代谢功能。

其中，微生物的双组分系统信号转导机制，可应对多种环境变化、代谢和细胞周期信号，感应pH、养分、氧化还原状态、渗透压力和抗生素等[41]。群体感应功能可感知环境变化，启动相应基因调控表达，从而调节微生物群落行为[42]。在深海高压、高盐、氧化还原等多重环境因子作用下，不同生境的微生物群落会通过“共适应理论”来调控细胞内能量的分配，产生适应环境的各种厌氧代谢途径，这可能是铁锰还原菌、硝化功能菌等出现的一种机制[43-44]。

嘧啶代谢、乙醛酸和二羧酸代谢及各类氨基酸代谢是微生物群落应对特异环境产生的保护机制。如：四氢嘧啶(Ectoine)及其衍生物羟基四氢嘧啶(5-hydroxyectoine,5-HE)是嗜盐微生物细胞内合成的一类能够抵抗外界高盐胁迫的相容溶质[45]，它具有保护细胞及细胞膜，增强蛋白质和核酸，抵抗高盐、高温、冷冻和干燥等极端环境的能力。

3.3 沉积扰动对表层沉积物微生物多样性的影响

研究区的细菌群落组成、PICRUSt功能预测数据表明，BC1826站的细菌多样性以及功能代谢与其他站位存在明显差异，这一差异与粒度分析结果一致，并且两者存在一定的响应关系。例如，与其他站相比，BC1826站中交替单胞菌目、弧菌目和绿弯菌门的比例有明显提高。YE et al[46]在近海低氧区发现弧菌丰度随沉积物粒径增大而增加，表明其对不稳定环境较高的适应性，而HARRISON et al[20]对加利福尼亚州和明尼苏达州两地浊积岩沉积微生物多样性分析显示，绿弯菌对沉积物扰动和有机质差异敏感，可间接作为沉积扰动的判别依据。

近期研究发现，研究区附近的Suda海山曾经历了多期次的山体垮塌，形成延绵百余公里的大型滑坡体[21]。由此推测，本研究中的BC1826站位可能也经历了类似的地质事件，并对表层沉积物细菌群落结构产生了深远影响。

已有的原位深海结核试采实验研究表明，在中等强度采矿扰动下，深海微生物群落的再定殖经历的时间较长，微生物数量和代谢活性在采矿扰动停止26 a后仍明显低于未扰动区[47]。这与本研究中经历地质活动引发的沉积扰动后，BC1826站位微生物群落多样性减少以及群落优势功能类群的改变是相似的。

4 结论

本文采集了马尔库斯-威克海山区6个站位的表层沉积物样品，采用高通量测序技术分析了细菌的群落结构及功能群组成，并结合粒度讨论了细菌群落对沉积环境变化的响应。结果表明，西太平洋马尔库斯-威克海山洋盆结核区不仅具有与东太平洋结核区不同的细菌群落组成，并且参与铁、锰、氮和硫元素循环的相关类群也有较大差别。研究区内细菌群落结构整体较稳定，相似度较高，局部站位受沉积扰动影响，细菌群落多样性降低，功能类群发生明显改变。