黄芪甲苷IV减轻尿毒症模型大鼠肾血管内皮损伤

朱文胜，郑忠毓，李晓霞，邓建南，张吉春

(重庆市万州区第五人民医院 肾内科， 重庆 404100)

尿毒症(uremia)是各种晚期的肾脏病共有的临床综合征。在中国，尿毒症发病率和病死率随着老龄化人口的增加而不断上升[1]。目前研究发现，血管内皮功能障碍，是尿毒症的首要死亡原因，也是临床研究的重点和难点问题[2]。核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor2,Nrf2)/血红素氧合酶-1(hemeoxygenase1，HO-1)在细胞抗氧化损伤和抗炎性损伤过程中发挥主要作用，并参与血管内皮损伤过程[3]。黄芪甲苷Ⅳ(astragaloside Ⅳ)是中药黄芪的主要活性成分，具有抗炎、降血脂、改善糖尿病引起的血管病变和心肌病等作用[4]，但其作用机制尚不清楚，本文通过肾脏切除法建立大鼠尿毒症模型，对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级SD雄性大鼠，体质量：220～240 g[广东省医学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(粤) 2016-0002]，动物质量合格证号为省科委2000A027。

1.1.2 主要试剂 黄芪甲苷Ⅳ(上海阿拉丁生化科技有限公司)；Nrf2抑制剂(MedchemExpress公司)；白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫(ELISA)试剂盒和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；肌酐(Scr)ELISA试剂盒(上海一研生物科技有限公司)； 尿素氮(blood urea nitrogen，BUN) ELISA试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司)；血β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)ELISA试剂盒(上海研生实业有限公司)；兔抗大鼠一抗Nrf2、HO-1(Proteinech Group公司)；小鼠抗CD31、兔抗内皮型一氧化氮(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、血管生成素样蛋白6(angiopoietin like protein 6，ANGPTL6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：取70只大鼠，按文献[5]方法切除占肾脏1/3的上极和下极左肾肾脏，术后1周进行完全摘除右肾手术，制备尿毒症模型，4周后大鼠成活，随机取2只大鼠剩余肾脏进行镜检，若出现肾血管内皮出现水肿、增大现象，视为造模成功，共造模成功60只(有3只于术后1周死亡，2只术后3周死亡，3只手术失败死亡)，将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄芪甲苷低(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)剂量组、Nrf2抑制剂组(2 mg/kg)、黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组(200 mg/kg+2 mg/kg)，每组12只。另取12只大鼠，仅行麻醉和暴露双肾，不做手术切除，作为假手术组。黄芪甲苷及Nrf2抑制剂参照文献[6-7]设置剂量，用0.9%氯化钠溶液稀释成为10.0、20.0、0.2 mg/mL的混悬液，按10 mL/kg的剂量腹腔注射给药，黄芪甲苷给药3次/d，Nrf2抑制剂给药1次/d；黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组给予黄芪甲苷的同时腹腔注射给予Nrf2抑制剂；假手术组及模型组给予等量0.9%氯化钠溶液，各组均连续给药4周，给药期间观察大鼠行为及死亡状况。

1.2.2 采集标本及透射电镜观察肾血管病变：末次给药12 h后，麻醉大鼠，取腹主动脉血3 mL，3 000 r/min离心10 min后，取上清液于-20 ℃冰箱保存备用。处死大鼠，解剖取剩余肾脏组织，经磷酸缓冲盐冲洗后，切取肾组织0.5 g置于-80 ℃冰箱保存，剩余肾组织分成2部分，一部分送于电镜室进行镜检并观察拍照；另一部分制成冰冻切片备用。

1.2.3 ELISA检测大鼠血清Scr、BUN、β2-MG、TNF-α、IL-6水平：以ELISA试剂盒说明书方法检测Scr、BUN、β2-MG及血清TNF-α、IL-6水平。

1.2.4 免疫荧光检测肾组织ROS蓄积水平：取部分新鲜冰冻切片，加入二氢乙啶(dihydroethidium，DHE)探针并于室温下孵育20 min后，置于荧光显微镜下观察组织染色情况。并随机取5个视野，用Image Pro Plus 5.0图像分析系统以单位面积内绿色荧光强度强弱代表细胞中ROS相对水平。

1.2.5 免疫荧光检测CD31与Nrf2在肾组织中表达：取切片，加入特丁基对苯二酚及0. 25%曲拉通(Triton X-100)处理透化后，加入一抗(兔抗鼠Nrf2、小鼠抗大鼠CD31，(1∶200))4 ℃孵育过夜，加入二抗(TRITC标记的山羊抗兔IgG、FITC标记的山羊抗小鼠IgG，稀释倍数为1∶200)孵育显色后，用防猝灭液封片后于激光共聚焦显微镜下观察，拍照。

1.2.6 免疫组化法检测肾组织HO-1、eNOS阳性表达：抗原修复后，加入一抗抗体(HO-1、eNOS，1∶500)室温孵育过夜后，加入羊抗兔二抗(1∶1 000)室温孵育后，加DAB显色、苏木精复染封片后于光镜下拍照，随机取5个视野，观察肾组织血管染色情况，并采用Image Pro Plus 5.0图像分析系统分析被染成棕黄色的区域域面积，结果以5个视野阳性表达的平均吸光度值表示。

1.2.7 Western blot检测大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1蛋白表达水平：将-80 ℃冻存的肾组织，4 ℃解冻后，于冰上用组织匀浆器匀浆，离心分离后，用蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法检测蛋白浓度后，取50μL进行电泳和转膜反应，并加入一抗(ANGPTL6、MCP-1(1∶1 000)，β-actin(内参，1∶2 000)抗体4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的羊抗兔二抗溶液(1∶2 000)室温孵育4 h，用化学发光法显色，以化学发光仪观察条带并拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠一般行为的影响

假手术组大鼠无死亡。模型组、黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组有3只死亡，大鼠形体消瘦、生长缓慢，饮食较少。黄芪甲苷低、高剂量组大鼠给药期间无死亡，且体重减轻及饮食减少现象有所改善。Nrf2抑制剂组有5只死亡，且体质量减轻、饮食减少现象进一步加重。

2.2 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平的影响

与假手术组相比，模型大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平回降(P<0.05)，且高剂量组优于低剂量组；Nrf2抑制剂组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平升高(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平

2.3 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织病理损伤的影响

假手术组大鼠肾小管毛细血管周结构正常；与假手术组相比，模型组大鼠肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大、管腔狭窄及受压明显；与模型组相比，Nrf2抑制剂组肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大进一步增加；黄芪甲苷低、高剂量组大鼠上述病理损伤减轻明显，且随黄芪甲苷剂量增加上述病理损伤改善越显著；黄芪甲苷+Nrf2抑制剂组上述病理损伤与模型组相近(图1)。

2.4 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织ROS水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠肾组织ROS水平升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织ROS水平回降(P<0.05)，且随剂量升高其回降越明显；Nrf2抑制剂组大鼠肾组织ROS水平升高(P<0.05)(图2，表2)。

A.sham operation group; B.model group; C.astragaloside Ⅳ low dose group; D.astragaloside Ⅳ high dose group;E.Nrf2 inhibitor group; F.astragaloside Ⅳ + Nrf2 inhibitor group

表2 各组大鼠肾组织ROS水平比较

2.5 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6水平回降(P<0.05)，且随剂量升高其回降越明显；Nrf2抑制剂组大鼠血清TNF-α、IL-6升高(P<0.05)(表3)。

表3 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响

2.6 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织Nrf2及CD31阳性共表达的影响

与假手术组相比，模型组大鼠肾组织Nrf2+CD31+水平升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织Nrf2+CD31+水平进一步升高(P<0.05)，且随剂量升高其升高越明显； Nrf2抑制剂组大鼠血清Nrf2+CD31+水平回降(P<0.05)(图3，表4)。

表4 大鼠肾组织Nrf2及CD31阳性表达的影响

2.7 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织HO-1及VEGF阳性表达的影响

假手术组大鼠肾小管上皮细胞区域、肾小球内皮细胞区域及肾小球系膜细胞区域HO-1及eNOS染色较弱。与假手术组相比，模型组大鼠肾组织上述区域eNOS及HO-1阳性表达升高(P<0.05)；与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织eNOS阳性表达降低(P<0.05)，HO-1阳性表达升高(P<0.05)，且黄芪甲苷剂量越高上述指标变化越明显；Nrf2抑制剂组eNOS阳性表达升高(P<0.05)，HO-1阳性表达降低(P<0.05)(图4，表5)。

表5 大鼠肾组织HO-1及eNOS阳性表达水平比较Table 5 Comparison of HO-1 and eNOS positive expression levels in rat

A.sham operation group; B.model group; C.astragaloside Ⅳ low dose group; D.astragaloside Ⅳ high dose group; E.Nrf2 inhibitor group; F.astragaloside Ⅳ+Nrf2 inhibitor group

2.8 黄芪甲苷Ⅳ对大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1表达升高(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷低、高剂量组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1表达回降(P<0.05)，且黄芪甲苷剂量越高上述指标变化越明显；Nrf2抑制剂组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1表达升高(P<0.05)(图5，表6)。

表6 各组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1蛋白表达水平比较Table 6 Comparison of protein expression levels of ANGPTL6 and MCP-1 in renal tissues of rats in each group

3 讨论

肾血管微循环结构或功能损坏可引起肾小球、肾小管及肾间质损害[8]。低氧条件及炎性刺激下，肾小管周毛细血管更易受到损害[9]。尿毒症患者血液中Scr、BUN、β2-MG等毒素大量积聚，是导致血管内皮功能失调的主要原因[10]。另外，尿毒症患者体内炎性因子IL-6、TNF-α升高，可促进红细胞在毛细血管管腔积聚、引起血管内皮功能损伤、导致肾毛细血管血流中断，而加重肾损伤[11]。本研究发现，模型组大鼠血清Scr、BUN、β2-MG等毒素及炎性因子IL-6、TNF-α升高的同时，肾小管周毛细血管管腔红细胞聚集、内皮细胞肿胀及增大等肾血管病变加重，预示模型造模成功。

A.sham operation group; B.model group; C.astragaloside Ⅳ low dose group; D.astragaloside Ⅳ high dose group; E.Nrf2 inhibitor group; F.astragaloside Ⅳ + Nrf2 inhibitor group

A.sham operation group; B.model group; C.astragaloside Ⅳ low dose group; D.astragaloside Ⅳ high dose group; E.Nrf2 inhibitor group; F.astragaloside Ⅳ+Nrf2 inhi-bitor group图5 Western blot检测各组大鼠肾组织ANGPTL6、MCP-1蛋白的表达Fig 5 Western blot of ANGPTL6 and MCP-1 protein expression in renal tissue of rats in each group

炎性因子TNF-α、IL-6还可激活细胞外信号调节激酶(ERK) 通路激活来调控炎症及氧化应激反应，并促进血管内皮及组织损伤。炎性因子及氧化应激均可促进肾组织及内皮细胞释放ANGPTL6，并通过激活ERK-eNOS信号通路，来促进内皮细胞释放NO，诱导肾小球及肾小管血管内皮细胞释放MCP-1来诱导炎性细胞聚集，从而加重肾脏血管病变[12]。本研究发现模型组大鼠肾组织中ANGPTL6、MCP-1表达升高的同时，eNOS表达也明显升高，提示ANGPTL6/eNOS/MCP-1可能与肾血管内皮损伤关系密切。

Nrf2//HO-1通路是抵御外界炎性反应及氧化应激的防御性传导通路，且与肾损伤关系密切。研究证实，ERK磷酸化，可促进Nrf2释放并激活抗氧化酶如HO-1表达，来抑制ROS水平升高，发挥抗氧化反应[13-14]。本研究发现，模型组大鼠Nrf2/HO-1在血管内皮细胞中表达升高，而用Nrf2/HO-1通路抑制剂阻断Nrf2/HO-1表达后，大鼠死亡、肾组织炎性损伤、肾血管病变进一步加重，提示抑制Nrf2/HO-1通路活化，可加重肾血管内皮损伤。黄芪甲苷Ⅳ对肾脏具有保护作用，能抑制体外培养的人血管内皮细胞凋亡[15]。本研究发现随着黄芪甲苷Ⅳ剂量的升高，大鼠肾组织Nrf2/HO-1激活；大鼠肾组织炎性及氧化应激损伤、肾血管内皮损伤缓解越明显，提示黄芪甲苷Ⅳ发挥抗尿毒症肾损伤作用，可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。Nrf2抑制剂可逆转黄芪甲苷Ⅳ上述作用。

综上所述，黄芪甲苷Ⅳ可能通过促进Nrf2/HO-1通路介导的抗炎、抗氧化途径激活，减轻尿毒症大鼠肾血管内皮损伤。为阐明黄芪甲苷保护尿毒症肾损伤的机制提供了新的可能机制，但尿毒症肾血管内皮损伤的机制复杂，还涉及自噬过程，黄芪甲苷Ⅳ保护尿毒症肾血管损伤的其他可能机制还有待进一步深入研究。