何氏养巢方对DOR小鼠超排卵和卵母细胞质量的影响*

杨柳青 方晓红 王如烨 陈 赟 沈 丹 杜婷婷 章 勤#

1 浙江中医药大学附属杭州市中医院 浙江 杭州 310007

2 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

何氏养巢方在何氏祖传经验方——育麟方的基础上优化而成，多年临床应用显示其能显著改善卵巢储备功能减退（DOR）患者的卵巢功能。本研究在前期研究基础上，进一步观察何氏养巢方对DOR小鼠超排卵及卵母细胞质量的影响，为中医药在辅助生殖领域的运用奠定基础，为DOR不孕症提供更完善的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物：6～8周龄SPF级C57BL/6J雌鼠24只、雄鼠2只，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心。

1.2 主要药品：每剂何氏养巢方由天冬、当归、柏子仁、菟丝子、肉苁蓉、覆盆子、白芍各10g，葛根20g组成，经浙江省中医药研究院制备成含生药3.6g/g的浸膏。脱氢表雄酮（DHEA）（商品名：NUGORON，产地：中国香港，批号：DN165152）。

1.3 主要试剂与仪器：环磷酰胺（CTX）、M16培养液、KSOM培养液购自Sigma公司，瑞氏-姬姆萨染色液购自上海源叶生物科技有限公司，小鼠抗人八聚体结合转录因子4（OCT4）单克隆抗体购自Abcam公司，孕马血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）购自宁波第二激素厂，Nikon牌荧光显微镜，二氧化碳培养箱（上海天能科技有限公司），Olympus牌体式显微镜，恒温烤箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.4 分组与造模：将雌鼠按随机数表法分为对照组（Control），DOR组，DHEA组，何氏养巢方低、中、高剂量组（Low-HSYC、Mod-HSYC、High-HSYC），每组4只。除对照组外，其余组予90mg/kg CTX腹腔注射建立DOR模型。

1.5 用药：根据体表面积换算法[1]，何氏养巢方成人每天剂量90g，以标准剂量的0.5、1、2倍分低、中、高浓度进行灌胃，给药量分别为 3.25g/kg·d-1、6.5g/kg·d-1、13g/kg·d-1浸膏；DHEA成人剂量75mg/d，小鼠给药量为9.75mg/kg·d-1，对照组、DOR组予0.2ml生理盐水灌胃。

1.6 超排与取卵：雌鼠腹腔注射PMSG 48h后再注射HCG，两种促性腺激素注射量均为10IU/只，HCG给药后14～16h予脊椎脱臼法处死小鼠，收集卵丘卵母细胞复合体（COCs）并放入二氧化碳培养箱暂存。

1.7 精子收集及获能：颈椎脱臼法处死雄性小鼠，将附睾尾获取的精子放入提前准备获能皿，置入37℃、5% CO2培养箱培养1小时以获能。

1.8 体外受精：将COCs加入受精液中，随即加入获能精子，置于37℃、5% CO2培养箱中进行受精，孵育时间为6h左右。受精结束后，将受精卵移入37℃、5% CO2条件下含有新鲜KSOM的培养皿，24h后统计2-细胞胚胎数，96h后统计囊胚数。

1.9 囊胚中OCT4免疫荧光染色：挑出形态良好的囊胚，预处理后转入OCT4一抗中，4℃孵育过夜，次日用洗脱液洗涤3次，然后将囊胚转移至含有Alexa Fluor 555染料标记的二抗中，室温避光孵育孵1h，用洗脱液洗涤3次，然后DAPI染核，封片后在荧光显微镜下观察并记录。

1.10 统计学方法：用 GraphPad prism软件分析实验数据，计量资料结果表示为Means±SD，P＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 何氏养巢方对DOR小鼠促排卵数的影响：见图1。

图1 各组小鼠促排后收集的COCs数比较

2.2 何氏养巢方对DOR小鼠卵母细胞质量的影响：见图2。A组表示各组2-细胞胚胎数；B组表示各组囊胚数。

图2 各组小鼠早期胚胎发育情况

2.3 何氏养巢方对胚胎质量的影响：见图3。

图3 各组小鼠囊胚的OCT4阳性细胞百分比

3 讨论

DOR患者在体外受精（IVF）过程中往往对促排卵药物不敏感，其常表现为获卵少且卵子质量低下，往往是IVF失败的主要原因。如何改善DOR患者的生殖功能，在IVF过程中获得适量且高质量的卵子是目前生殖医学研究的热点和难点。

根据DOR的临床表现，可将其归属中医学“不孕”“血枯”等范畴[2]。中医学认为肾藏精，主生殖，卵子的生长发育有赖于肾精充足，肾精亏虚是DOR的主要病机，临床辨证论治常以补肾填精为主[3]。中医药与ART联合应用于DOR不孕症患者的助孕治疗往往可取得较好的疗效。

IVF以非侵袭性方式避免了对卵母细胞进一步发育造成的不利影响，是评价卵母细胞质量优劣直接、无创、可靠的方法[4]。以往研究显示，DHEA能提高C57BL/6J小鼠超排卵效果，改善卵母细胞质量[5]。本研究发现，补肾填精中药何氏养巢方以剂量依赖性方式增加了DOR小鼠IVF中的获卵数、2-细胞胚胎数以及囊胚数等，且效果优于DHEA。

OCT4在内部细胞团（ICM）中特异性表达，OCT4缺陷或表达水平低的小鼠胚胎无法形成ICM，失去多能性及自我更新能力[6]。本研究发现，何氏养巢方能显著提高DOR小鼠囊胚中OCT4阳性细胞比例，激发胚胎发育潜能，提高胚胎质量。然而，胚胎质量优劣与卵母细胞质量高低密切相关，这也反映了何氏养巢方具有提高DOR小鼠卵母细胞质量的作用。

综上，何氏养巢方可以提高DOR小鼠超排卵后获卵数和卵母细胞质量，将补肾填精中药复方与辅助生殖技术相结合，成为了中医理论“肾藏精，主生殖”的又一力证，并为进一步探讨中医药在辅助生殖领域中的作用奠定了基础。