肝硬化上消化道出血合并细菌感染影响因素及其血清miRNA-122与预后关系

刘海云，吴 艳，沈爱武，王 霞

肝硬化是临床常见肝脏疾病，病因以病毒性肝炎最为常见，随着病情进展，患者可因门脉高压和食管胃底静脉曲张破裂引发上消化道出血，并引起严重继发感染，而继发感染不仅增加了治疗成本及难度，还提高了病死率，故寻找与此类患者预后相关的指标以指导临床干预具有重要意义[1]。miRNA是一类小型内源性非编码RNA分子，可通过与信使RNA结合影响蛋白编码基因表达，进而参与细胞增殖、分化和凋亡等病理生理过程[2]。miRNA-122为在肝组织中表达最丰富的一种miRNA分子。有研究显示，miRNA-122表达与乙型肝炎病毒相关性肝癌发生和发展密切相关，对肝癌诊断及预后评估有一定价值[3]。还有研究报道，miRNA-122与脓毒症休克合并肝损伤患者病情及预后相关[4]。然而，目前临床关于miRNA-122对肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者的影响尚不清楚。本研究探讨肝硬化上消化道出血合并细菌感染影响因素及其血清miRNA-122与预后关系，现报告如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年6月—2021年3月如皋市人民医院收治的肝硬化上消化道出血合并细菌感染80例作为感染组。纳入标准：①符合肝硬化诊断标准[5]，且经临床表现和影像学检查诊断为上消化道出血；②符合细菌感染诊断标准[6]；③年龄>18岁；④接受规范治疗；⑤患者和(或)其家属签署相关知情同意书。排除标准：①合并恶性肿瘤、严重心脑血管疾病、血液系统疾病和获得性免疫缺陷综合征等严重影响预后疾病；②入院后48 h内死亡；③合并真菌感染；④精神障碍；⑤治疗依从性差。另选取同期该院收治未合并细菌感染的肝硬化上消化道出血80例作为非感染组，除细菌感染诊断外纳入及排除标准与感染组一致。本研究经医院医学伦理委员会批准同意执行。

1.2方法

1.2.1一般资料收集：收集所有入选患者一般资料，包括性别、年龄、体质量指数、肝硬化病因、肝硬化病程、肝硬化分期、Child肝功能分级、出血严重程度(出血量<500 ml和≥500 ml分别为轻度和中重度)[7]、腹腔积液、急性生理与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分[8]及入院时血红蛋白、血小板、白蛋白水平。

1.2.2血清miRNA-122检测：采集所有入选患者入院后第2天清晨空腹肘静脉血5 ml，于4 ℃下3000 r/min离心15 min，收集上清液，于-80 ℃条件下保存备用。采用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)从血清中提取总RNA，严格按照试剂盒说明书进行操作；于无菌条件下，采用NanoDrop 1000型紫外分光光度计(美国Nanodrop公司)检测RNA纯度，A260/A280值在1.8～2.0视为合格。采用实时荧光定量PCR法(美国BIO-RAD公司，C1000 Thermal cycler PCR仪)，以两步法检测miRNA-122，先使用逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)行逆转录，miRNA-122引物序列：上游引物5'-GACGTCGACTAAGAATGTGAAGGTGAAGTT-3'，下游引物5'-CACGGATCCACAAGATTGAGAAGACTAATA-3'，反应条件:37 ℃60 min、95 ℃3 min，获得逆转录产物cDNA，采用SYBR premix EX taq试剂盒行样品上样；再行实时荧光定量PCR(试剂盒购自美国Invitrogen公司)，每个样品设置3个重复孔，扩增条件：94 ℃预变性 3 min、95 ℃变性5 s、60 ℃退火 30 s，共40个循环，72 ℃终延伸5 min；以U6(美国Invitrogen公司)为内参基因，采用2-ΔΔCt定量分析miRNA-122相对表达量。

1.2.3预后评估[8]：根据住院28 d治疗结果，将肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者分为好转组(57例，治疗后临床症状和实验室指标好转，或治疗后痊愈出院)和恶化组(23例，治疗后临床症状和实验室指标无好转甚至恶化，或住院期间死亡)两组。

1.3观察指标 采用单因素和多因素Logistic回归分析探讨肝硬化上消化道出血合并细菌感染影响因素，分析肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者血清miRNA-122与Child肝功能分级、APACHEⅡ评分相关性，比较好转组和恶化组血清miRNA-122，探讨血清miRNA-122对肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者预后预测价值。

2 结果

2.1肝硬化上消化道出血合并细菌感染影响因素单因素分析 单因素分析结果显示，感染组肝硬化失代偿期、Child肝功能分级B级或C级、中重度出血、有腹腔积液所占比例和APACHEⅡ评分、血清miRNA-122高于非感染组，入院时血红蛋白和白蛋白低于非感染组(P<0.05或P<0.01)，见表1。

表1 肝硬化上消化道出血合并细菌感染影响因素单因素分析

2.2肝硬化上消化道出血合并细菌感染影响因素多因素Logistic回归分析 以细菌感染为因变量，单因素分析中差异有统计学意义的影响因素为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示肝硬化失代偿期、中重度出血、APACHEⅡ评分≥25分和血清miRNA-122≥2.4是肝硬化上消化道出血合并细菌感染的独立危险因素，入院时白蛋白≥22 g/L是肝硬化上消化道出血合并细菌感染的保护因素(P<0.05或P<0.01)，见表2。

表2 肝硬化上消化道出血合并细菌感染影响因素多因素Logistic回归分析

2.3肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者血清miRNA-122与Child肝功能分级、APACHEⅡ评分相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者血清miRNA-122与Child肝功能分级、APACHEⅡ评分均呈正相关(r=0.391，P=0.002；r=0.286，P=0.021)。

2.4好转组和恶化组血清miRNA-122比较 血清miRNA-122好转组为2.38±0.55低于恶化组3.03±0.49(P<0.01)。

2.5血清miRNA-122对肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者预后预测价值 受试者工作特征曲线分析结果显示，血清miRNA-122对肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者预后预测价值的曲线下面积为0.814(95%CI 0.713,0.914，P<0.001)，最佳截断值为2.85，对应的敏感度和特异度分别为73.90%和78.90%，见图1。

图1 血清miRNA-122对肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者预后预测价值的受试者工作特征曲线

3 讨论

肝硬化患者因肝细胞受损，蛋白质合成能力下降，免疫功能较差，对细菌清除及防御能力下降，当门脉高压引起胃肠淤血后，可损伤肠道黏膜屏障功能，引起肠道菌群移位，增加细菌感染风险[9]。有研究显示，20%～40%的肝硬化上消化道出血患者可伴细菌感染[10]。夏文恬等[11]报道，肝硬化上消化道出血并发细菌感染主要影响因素为肝硬化失代偿期、出血严重程度及住院时间；崔宏等[12]研究显示，肝硬化合并腹腔感染以革兰阴性菌为主，且对第三和四代头孢菌素耐药率较高。然而，现临床上关于肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者预后评估的研究并不多见。本研究分析肝硬化上消化道出血合并细菌感染影响因素及其血清miRNA-122与预后关系，以期为此类患者预后评估及感染防控提供新的思路。

miRNA与多种疾病发生和发展密切相关，且血清miRNA不易被RNA酶降解，故血清miRNA成为多种疾病热门生物学标志物[13]。miRNA-122位于染色体17q23.2的FRA17B脆性区域，有自主调控基因转录作用。有研究报道，miRNA-122可与阳离子氨基酸转运蛋白(CAT-1)信使RNA结合，并通过抑制CAT-1合成来介导机体蛋白质合成障碍[14]。还有文献报道，miRNA-122能与抗凋亡基因家族Bcl-2和Bcl-xL的信使RNA结合并抑制抗凋亡基因表达，进而加速细胞凋亡[15]。本研究结果显示，感染组血清miRNA-122高于非感染组，提示血清miRNA-122可能与肝硬化上消化道出血合并细菌感染有关。有研究报道，脓毒症患者血清miRNA-122升高，其一方面通过抑制CAT-1合成加重机体蛋白质合成障碍;另一方面通过抑制抗凋亡基因表达来介导大量淋巴细胞凋亡，使机体获得性免疫功能降低，从而引起难以控制的继发性感染[16]。本研究多因素Logistic回归分析结果显示，血清miRNA-122≥2.4是肝硬化上消化道出血合并细菌感染的独立危险因素，提示血清miRNA-122与肝硬化上消化道出血患者细菌感染相关。其机制可能与miRNA-122影响机体蛋白质合成和促进免疫细胞凋亡有关。

Child肝功能分级越高说明患者肝损伤越严重[17]。本研究结果显示，肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者血清miRNA-122与Child肝功能分级呈正相关，提示血清miRNA-122与肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者肝损伤有关。有研究报道，血清miRNA-122升高与脓毒症肝损伤有关[18]；还有文献显示，慢性丙型肝炎患者血清miRNA-122升高，升高程度与肝组织炎症坏死程度有关[19]。本研究结果与上述研究结果相似。APACHEⅡ评分在重症医学科患者病情及预后评估中有重要作用，分值越高，病情越重，死亡风险越高[20]。本研究结果显示，肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者血清miRNA-122与APACHEⅡ评分呈正相关，提示血清miRNA-122可能与肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者病情严重程度相关。本研究结果还显示，血清miRNA-122好转组低于恶化组，提示血清miRNA-122可能参与肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者病情进展。此外，本研究受试者工作特征曲线分析结果显示，血清miRNA-122对肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者预后预测价值的曲线下面积为0.814，最佳截断值为2.85，提示血清miRNA-122对肝硬化上消化道出血合并细菌感染患者预后有一定预测价值。然而，本研究为单中心研究且样本量有限，研究结果有待进一步研究验证。

总之，血清miRNA-122是肝硬化上消化道出血合并细菌感染的影响因素，与其肝功能、病情严重程度呈正相关，对其预后有一定预测价值。