微波辅助离子液体提取光果莸黄酮工艺的优化*

闫 平，张 彦，郑 松

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

光果莸(CaryopteristanguticaMaxim.)是马鞭草科莸属植物,主要分布于中国陕西、河南、甘肃、四川等地的干燥山坡或路边，高0.5～2 m，常野生，是羌族民间药用植物,具有解毒消肿、消食理气、活血止痛以及杀虫等功效[1],常用于治疗皮肤湿疹、酒疮、女性崩漏、白带和月经不调等疾病。研究发现莸属植物具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[2]，光果莸提取物具有抗氧化活性，对DPPH自由基、O2-自由基均有良好清除的作用，但是文献中光果莸黄酮的提取还只是传统的索氏提取，提取效率比较低[3]，因此优化光果莸黄酮的提取工艺，提高光果莸黄酮得率是研究的关键一步，通过文献查阅，目前微波辅助离子液体在天然产物的提取中表现出非常好的辅助优势[4]。

离子液体[5-6]是一种绿色溶剂，在室温下呈液体，其分子作用力和强溶解能力有利于有效成分的溶解，具有稳定性好、溶解度高、蒸气压低、应用范围广、电学性质优异、安全性高、可重复利用、对微波有良好的吸收效果等优点[7-10]；但离子液体黏度高，不易从所获得的产物中分离，需要用有机溶剂或超临界CO2进行反萃，并且价格高昂、具有一定的生物毒性，在后期开发中存在困难。实验中选择的离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑溴盐(C8H15N2Br)，分子量219.12，简写[BMZm]Br，其提取范围较广，对于黄酮类化合物具有不错的提取效果[11]，但由于黏度较大，所以实验中将离子液体加入到体积分数为70%的乙醇中稀释后再作为提取溶剂使用。

研究采用微波辅助离子液体的方法，结合响应曲面法以及Design-Experts设计响应面实验优化出光果莸黄酮的最佳提取工艺，为后期研究光果莸黄酮生物活性提供一定的理论基础。

1 实验部分

1.1 原料、试剂与仪器

光果莸：采自太白山眉县，经生药教研室汪兴军老师鉴定为马鞭草科光果莸；芦丁：L9W6-8YWD，中国食品药品检定研究院。

1-丁基-3-甲基咪唑溴盐：纯度≥97%，中科院兰州化学物理研究所；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇：分析纯，市售。

微波超声合成/萃取仪：XH-300A，北京祥鹄科技发展有限公司；紫外可见分光光度计：UV-762，上海佑科仪器仪表有限公司；电子天平：PTY-B5000，福州华志科学仪器有限公司；循环水式多用真空泵：SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司；数显控温电热套：SXKW，北京市永光明医疗器械厂；鼓风干燥箱：BOV101-70-Ⅱ，济南鑫贝西生物技术有限公司；旋转蒸发器：XD-52AA，上海贤德实验仪器有限公司；密封型摇摆式粉碎机：XL-16B，广州市旭朗机械设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 光果莸黄酮样品溶液的制备

取干燥的光果莸粉碎过筛，t=40 ℃烘干至质量恒定，索氏提取，t=80 ℃石油醚脱脂加热回流至无色，取出药材提取包，自然挥发干燥，得到样品粉末。

精密称取一定量的样品粉末置于三颈烧瓶中，加入一定体积溶解有离子液体的φ(乙醇)=70%溶液，放入微波萃取器的化学反应器中，设置一定的微波功率、提取温度和反应时间，提取完成后抽滤，抽滤液转移至50 mL容量瓶中并定容，即得光果莸黄酮样品溶液。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品10.0 mg，溶解并定容于100 mLφ(乙醇)=70%溶液中，充分摇匀振荡，即得到ρ(芦丁)=0.10 mg/mL的标准溶液。

精密吸取芦丁标准溶液，按照不同质量浓度梯度进行配置，参考文献[12]在512 nm处测定吸光度，并绘制标准曲线，得到线性回归方程y=9.71x+0.055，R2=0.998 9。

1.2.3 光果莸黄酮含量测定

精密吸取光果莸黄酮样品溶液1 mL，移至10 mL容量瓶中，φ(乙醇)=70%溶液定容，充分摇匀，再吸取1 mL，按照1.2.2标准曲线绘制方法进行测定，并根据已得到的线性回归方程计算样品溶液的光果莸黄酮含量，计算光果莸黄酮得率。

1.3 光果莸黄酮单因素实验

用φ(乙醇)=70%溶液作溶剂，光果莸黄酮得率为评价指标，分别对微波功率、反应时间、V(提取液)∶m(原料)(以下简称液料比)、V(乙醇)∶V(离子液体)(以下简称离子液体体积比)4个参数进行单因素实验，以确定各因素对光果莸黄酮得率的影响以及良好的参数范围。

1.4 响应曲面设计实验

在单因素实验基础上，采用Design-Expert 8.0.6.1 Trial中的Box-Behnken，以微波功率(A)、反应时间(B)、粉末液料比(C)、离子液体体积比(D)4个因素为变量[13]，以光果莸黄酮得率为响应值，每个变量按高(+1)、中(0)、低(-1)3个水平进行分析，见表1。

表1 响应面分析因素及水平

2 结果与讨论

2.1 单因素提取光果莸黄酮实验结果

2.1.1 微波功率对光果莸黄酮得率的影响

精密称取0.50 g光果莸粉末于三颈烧瓶中，固定离子液体体积比为20、液料比为50 mL/g、反应时间为6 min，考察微波功率对光果莸黄酮得率的影响，见图1。

微波功率/W图1 微波功率对光果莸黄酮得率的影响

由图1可知，当微波功率从150 W增至550 W，黄酮得率呈上升趋势，可能的原因是物料吸收了微波能，内部的分子剧烈运动使细胞破裂，黄酮溶出增加，得率增高[14]；当功率从550 W继续增至950 W，得率呈下降趋势，可能的原因是随着微波功率增加，温度上升过快,导致黄酮稳定性降低。因此，在后续的响应曲面实验中采用350、550、750 W的微波功率梯度。

2.1.2 微波反应时间对光果莸黄酮得率的影响

精密称取0.50 g光果莸粉末于三颈烧瓶中，固定离子液体体积比为50、液料比为20 mL/g、微波功率为550 W，考察反应时间对光果莸黄酮得率的影响，见图2。

t/min图2 反应时间对光果莸黄酮得率的影响

由图2可知，t=4～8 min，黄酮得率升高，可能的原因是物料中的黄酮随反应时间的增加不断溶出，使得率增高；t=8～20 min，得率持续下降，但下降趋势较缓。其一可能是反应时间过长，长时间受热导致所溶出的黄酮被破坏，提取液中的黄酮含量减少，得率降低；其二可能是反应时间过长导致溶液中的杂质溶出增多，黄酮溶出减少，得率降低。因此，在后续的响应曲面实验中采用4、8、12 min的反应时间梯度。

2.1.3 粉末液料比对光果莸黄酮得率的影响

精密称取0.50 g光果莸粉末于三颈烧瓶中，固定离子液体体积比为50、反应时间为8 min、微波功率为550 W，考察液料比对光果莸黄酮得率的影响，见图3。

液料比/(mL·g-1)图3 粉末液料比对光果莸黄酮得率的影响

由图3可知，液料比为10～20 mL/g时，黄酮快速从植物细胞中溶解出来导致得率直线上升，液料比达到20 mL/g时，得率最高；当液料比继续增大时，过多的溶剂使微波能传递能力逐步减弱，细胞破裂不完全，黄酮不能充分溶解，导致得率不断下降。因此，在后续的响应曲面实验中采用10、20、30 mL/g的液料比梯度。

2.1.4 离子液体体积比对光果莸黄酮得率的影响

精密称取0.50 g光果莸粉末于三颈烧瓶中，固定液料比为20 mL/g、反应时间为8 min、微波功率为550 W，考察离子液体体积比对光果莸黄酮得率的影响，见图4。

离子液体体积比图4 离子液体体积比对光果莸黄酮得率的影响

由图4可知，当离子液体体积比从10增至40，黄酮得率不断提高，可能的原因是比值大时溶剂黏稠度变低，扩散能力增强，利于黄酮的溶出[15]；当比值从40增大至50，得率下降，但幅度较小，可能的原因是此时离子液体浓度较低，不利于萃取。因此，后续的响应曲面实验中采用30、40、50的离子液体体积比梯度。

2.2 响应曲面设计实验结果

2.2.1 响应曲面设计实验表

以光果莸黄酮得率(Y)为响应值，对表1进行四因素三水平评价，得率结果见表2。

表2 响应曲面设计实验表

对上述方程进行显著性检验和方差分析，黄酮得率回归模型结果见表3。

表3 显著性检验和方差分析表1)

2.2.2 响应面分析

单因素两两之间交互作用的响应曲面图见图5～图10。

图5 微波功率与反应时间的交互作用对光果莸黄酮得率的影响

由图5可知，A、B交互作用下光果莸黄酮得率的极值为23.58 mg/g，此时微波功率为750 W，反应时间为12 min，液料比为20 mL/g，离子液体体积比为40。

图6 微波功率与液料比的交互作用对光果莸黄酮得率的影响

由图6可知，A、C交互作用下光果莸黄酮得率的极值为25.74 mg/g，此时微波功率为750 W，反应时间为8 min，液料比为30 mL/g，离子液体体积比为40。

图7 微波功率与离子液体体积比的交互作用对光果莸黄酮得率的影响

由图7可知，A、D交互作用下光果莸黄酮得率的极值为18.30 mg/g，此时微波功率为550 W，反应时间为8 min，液料比为20 mL/g，离子液体体积比为40。

图8 反应时间与液料比的交互作用对光果莸黄酮得率的影响

由图8可知，B、C交互作用下光果莸黄酮得率的极值为18.30 mg/g，此时微波功率为550 W，反应时间为8 min，液料比为20 mL/g，离子液体体积比为40。

图9 反应时间与离子液体体积比的交互作用对光果莸黄酮得率的影响

由图9可知，B、D交互作用下光果莸黄酮得率的极值为18.30 mg/g，此时微波功率为550 W，反应时间为8 min，液料比为20 mL/g，离子液体体积比为40。

图10 液料比与离子液体体积比的交互作用对光果莸黄酮得率的影响

由图10可知，C、D交互作用下光果莸黄酮得率的极值为18.30 mg/g，此时微波功率为550 W，反应时间为8 min，液料比为20 mL/g，离子液体体积比为40。

通过Design-Exoert 8.0.6 Trial分析得到最佳提取工艺为微波功率750 W，反应时间10.77 min，液料比20.27 mL/g，离子液体体积比37.77，此时的光果莸黄酮得率预测值为22.99 mg/g。

2.3 验证性实验

在最优的提取条件下进行重复性实验，验证通过响应曲面建立模型的可靠性，综合考虑实操性，实际提取条件为微波功率750 W，反应时间11 min，液料比20 mL/g，离子液体体积比38，平行3次实验，测得光果莸w(黄酮)=24.83、24.97、25.22 mg/g，平均w(黄酮)=25.01 mg/g，接近预测值，说明响应曲面法优化得到的提取工艺稳定可行。

2.4 微波辅助离子液体提取光果莸不同部位w(黄酮)

在2.3中验证了优化后的提取条件，实验结果表明该条件具有一定的可行性，在该条件下对光果莸茎、叶、花中的黄酮平行3次提取，结果见表4。

表4 光果莸不同部位w(黄酮) mg/g

由表4可知，光果莸茎、叶、花3个部位中都含有一定量的黄酮，叶中最高，花中次之，茎中最少。

3 结 论

采用单因素分析结合响应曲面实验的方法，研究了微波辅助离子液体提取光果莸中黄酮的影响因素和工艺条件。实验结果表明，各因素对光果莸黄酮得率的影响大小关系依次为微波功率>反应时间>离子液体体积比>液料比，且微波功率影响最大。利用Design-Exoert优化出最佳提取工艺为微波功率750W，反应时间11 min，液料比20 mL/g，离子液体体积比38，在该提取工艺条件下的光果莸黄酮平均含量为25.01 mg/g。在微波辅助离子液体的双重作用下，提取光果莸黄酮具有反应时间短、提取效率高、消耗溶剂较少、实验操作简单、无污染等优点。

微波辅助提取技术具有高效、高得率、短提取时间等优点[16-17]，微波结合离子液体相辅相成，极大提高黄酮得率，缩短反应时间，且仪器操作简单，节省资源，绿色环保，可以为日后的工业发展作参考。