高效液相色谱- 串联质谱法（HPLC-MS） 测定苦丁茶中的孔雀石绿和隐色孔雀石绿

蒋 雨， 兑靖冬， 范志平

（ 宜宾市食品药品检验检测中心， 四川 宜宾 644000）

孔雀石绿是一种合成的三苯基甲烷类工业染料，在水产养殖业中用作杀虫剂和预防水霉剂[1-2]。 由于孔雀石绿残留时间长， 并有致突变、 致畸和致癌的危险性[3-5]， 因此中国、 美国、 加拿大等许多国家均禁止将其作为人类食用鱼的兽药使用[6]。 2002 年9 月实施的农业行业标准NY 5071—2002 中明确规定孔雀石绿为禁用渔药[7]。 《 农业农村部公告第250 号》明确规定， 孔雀石绿属于食品动物中禁止使用的药品及其他化合物[8]。 在近年来区县市场监管部门的委托送检中， 陆续在苦丁茶中检出了孔雀石绿及其代谢物成分。 但是， 国家现有标准中涉及孔雀石绿项目检测的品种主要有养殖水体、 饲料和水产品； 在已发表的论文中也仅有水体、 水产品及淀粉制品中孔雀石绿残留量的检测， 没有苦丁茶中孔雀石绿及其代谢物的测定方法。 因此， 建立苦丁茶中孔雀石绿及其代谢产物的检验方法很有必要。

1 材料与方法

1.1 耗材与试剂

中性氧化铝柱（1 g/3 mL） ， 上海安谱实验科技股份有限公司提供； 乙腈（色谱纯）， 山东禹王实业有限公司提供； 乙酸铵（ 分析纯） ； 孔雀石绿-D5 对照品 （ 232342， 100%） ； 隐 色 孔 雀 石 绿 对 照 品（ 00209， 97.0%） ； 隐 色 孔 雀 石 绿-D6 对 照 品（212023， 100%）； 苦丁茶样品为抽检样品。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200 HPLC-6410 Triple Quad LC/MS，Agilent 公司产品； CP225D 型万分之一电子天平，Sartorius 公司产品； ULUP-Ⅱ-10T 型超纯水机， 成都超纯科技有限公司产品； KQ-700DE 型数控超声仪。

1.2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18（ 2.1 mm×30 mm，3.5 μm） 色谱 柱， 流动相为乙腈（ 0.1%甲酸）-5 mmol/L 乙酸铵溶液（ pH 值4.5） （ 70∶30） ， 流速为1.0 mL/min， 进样量为10 μL， 柱温为35 ℃，采集时间5 min 。

1.2.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源， 采用正离子模式监测，雾 化 气 体， N2； 雾 化 器 压 力 为30 Psi， 干 燥 气 体：N2， 温度为350 ℃， 流速为9 L/min； 毛细管电压为4 000 V， 采用多重反应监测模式（MRM）。

1.3 方法

样品处理方法： 苦丁茶样品粉碎， 混匀， 称取约1 g 粉碎样品于25 mL 容量瓶中， 精密加入400 L 混合内标工作溶液， 加入适量乙腈， 超声提取20 min后， 用乙腈定容至25 mL， 摇匀， 转移至50 mL 离心管， 以转速4 000 r/min 离心5 min， 备用。 移取5.00 mL 上清液至已活化的中性氧化铝上， 用试管接收流出液， 4 mL 乙腈洗涤中性氧化铝柱， 收集全部流出液， 45 ℃下氮吹至约1 mL， 残液用乙腈定容至1.0 mL， 超声处理5 min， 加入1.0 mL 5 mmol/L 乙酸铵溶液（pH 值4.5） ， 超声溶解1 min， 样液经0.22 μm滤膜后， 立即用HPLC-MS 测定。

对照品溶液的制备方法： 精密称取孔雀石绿、孔雀石绿-D5、 隐色孔雀石绿、 隐色孔雀石绿-D6各约10 mg， 分别置100 mL 容量瓶中， 用乙腈溶解并定容至100 mL， 配制成质量浓度分别为100 μg/mL的标准贮备液（-18 ℃下避光保存） 。 混合标准工作溶液： 精密吸取孔雀石绿、 隐色孔雀石绿标准贮备液各0.1 mL 于同一100 mL 容量瓶中， 用乙腈定容至刻度， 配制成质量浓度约为0.1 g/mL 的混合标准工作溶液。 混合内标工作溶液： 精密吸取2 种氘代内标贮备液各0.1 mL 置于同一100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度， 配制成浓度约为0.1 g/mL 的混合内标工作溶液。 取混合标准工作溶液与混合内标工作溶液适量， 用乙腈+5 mmol/L 乙酸铵溶液（1+1）稀释成质量浓度分别为1， 2， 5， 10， 20， 50 μg/L，内标质量浓度为4 μg/L 的对照品溶液。

2 结果与分析

2.1 线性范围

取质量浓度为1， 2， 5， 10， 20， 50 μg/L， 内标浓度为4 μg/L 的对照品溶液10 μL， 在“ 1.2.1”项下的色谱质谱条件下进样， 记录定量子离子峰面积。 以待测组分定量子离子峰面积与内标定量子离子峰面积的比值（Y） 对待测组分对照品溶液质量浓度（X） 进行线性回归， 得到回归方程、 相关系数和线性范围。

孔雀石绿Y=0.305 8X+0.097 1（R=0.999 8）

隐色孔雀石绿Y=0.971 7X-0.907 2（R=0.999 5）

结果表明， 孔雀石绿1.088～54.400 μg/L， 隐色孔雀石绿1.056～52.800 μg/L 质量浓度范围内， 组分定量子离子峰面积与内标定量子离子峰面积比值的线性关系良好。

2.2 回收率的测定

取均质空白茶叶试样1 g， 置于25 mL 量瓶中，分别添加混合标准工作溶液500 μL（ 即添加量约为50 μg/kg）， 按“ 1.3” 项下的方法制备并测定含量， 计算回收率， 结果2 组分的平均回收率分别为89.16%，94.44%； RSD 分别为9.41%， 3.39%。

2.3 检出限、 定量限的测定

在空白茶叶样品中添加孔雀石绿和隐色孔雀石绿混合标准工作溶液， 以信噪比（ S/N） 等于3 为检出限标准； 以信噪比（S/N） 等于10 为定量限标准， 测定2 个待测组分的方法检出限和定量限。 孔雀石绿和隐色孔雀石绿的检出限分别为0.40 μg/kg与2.5 μg/kg； 孔雀石绿和隐色孔雀石绿的定量限分别为1.3 μg/kg 与8.3 μg/kg。

孔雀石绿、 隐色孔雀石绿的总离子流图见图1，孔雀石绿、 隐色孔雀石绿、 孔雀石绿-D5、 隐色孔雀石绿-D6 的提取离子流图见图2。

图1 孔雀石绿、 隐色孔雀石绿的总离子流图

图2 孔雀石绿、 隐色孔雀石绿、 孔雀石绿-D5、 隐色孔雀石绿-D6 的提取离子流图

2.4 样品测定

对抽检的5 份样品进行了检测， 总含量最高为5.87×103μg/kg， 最低为20.9 μg/kg。

样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿检测结果见表1。

表1 样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿检测结果/μg·kg-1

3 结论

孔雀石绿在1.088～54.400 μg/L， 隐色孔雀石绿1.056～52.800 μg/L 质量浓度范围内， 线性关系良好（R＞0.999） 。 孔雀石绿和隐色孔雀石绿的检出限分别为0.40 μg/kg 与2.50 μg/kg， 平均回收率为91.82%～106.70%， RSD≤12.6%。 用该方法检测抽检样品，5 份阳性样品总含量最高达5.87×103μg/kg。 从检测结果来看， 市场上确有苦丁茶中非法添加孔雀石绿及其代谢产物的情况， 加强苦丁茶中孔雀石绿检测方法建立， 对其进行有效检测， 对于保证食品安全、促进国民健康及社会经济发展具有重大意义。