内皮祖细胞来源的外泌体降低颅内动脉瘤破裂的研究进展*

尉辉杰 刘 卉 刘首峰 杨贵莉 俞 凯 岳树源 江荣才 张建宁

1 天津医科大学总医院神经外科，天津市 300052； 2 天津市神经病学研究所； 3 天津市环湖医院

目前，降低未破裂颅内动脉瘤(Unruptured intracranial aneurysms，UIAs)破裂的手术治疗方式主要是开颅夹闭术和介入栓塞。UIAs破裂的机制及降低其破裂的合理治疗方式尚不十分明确，寻找一种能有效降低UIAs破裂的非手术治疗方式具有重要意义。近年来，国内外研究提示，EPCs来源的外泌体(EPCs-Exos)介导的血管新生在血管损伤后内皮修复过程中发挥重要作用，可延缓颅内动脉瘤的进展，在降低颅内动脉瘤破裂方面具有重要意义。本文通过回顾国内外相关文献，并结合笔者课题组近年来的研究成果，将重点阐述EPCs-Exos参与降低颅内脉瘤破裂的机制及潜在应用前景，提出应用EPCs-Exos治疗未破裂颅内动脉瘤的创新策略，为临床转化奠定基础。

1 非手术治疗方式降低颅内动脉瘤破裂的重要临床意义

颅内动脉瘤(Intracerebral aneurysms，IAs)破裂后形成蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)，是一种神经外科常见急症。其预后差，病死率为45%～49% ，存活者的残障率超过50%[1]，给患者个人、家庭和国家带来沉重的精神压力和经济负担。近年来随着CTA、MRA等无创性血管检查的出现与普及，UIAs的发现率逐年提高。一直以来， 降低UIAs破裂风险的手术治疗方式主要是开颅夹闭术和介入栓塞。这两种治疗方式发生手术并发症的风险与UIAs破裂时可能出现的严重后果是几乎接近的。国内外学者一致认为，降低UIAs破裂风险的最理想方式应该是非手术治疗，如药物和细胞移植等。通过非手术治疗修复颅内动脉瘤受损的内皮，减小其体积，增加动脉瘤壁抗张性能以及降低破裂风险是当前研究的重点与热点问题之一。

2 过度炎症反应所引起的血管重塑能力下降在颅内动脉瘤破裂中的作用

以往研究认为颅底willis环动脉壁中膜层变薄和内弹力层退变是颅内动脉瘤形成的主要原因[2]。近年来有研究认为，血管内皮细胞受损是颅内动脉瘤形成的始动环节和促发因素。在持续异常高血流动力刺激下，血管分叉部内皮细胞易发生损伤，出现内皮功能障碍，可以激活内皮细胞内促炎症信号通路，引发由NF-κB介导，多种炎症介质(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-6、TNF-α、IL-1β)参与的血管壁过度炎症反应。MMPs介导的细胞外基质分解破坏，以及平滑肌细胞过度凋亡，致使血管结构重塑能力下降[3]。基于上述病理变化，在高血流作用下局部管壁继续外向膨出，动脉瘤不断进展恶化，直至破裂 。血管内源性保护机制及其微环境的紊乱可以引起一系列瀑布链式反应，激发血管内皮损伤进一步恶化，最终引起动脉壁结构的破坏，从而诱发颅内动脉瘤的形成、发展至破裂。因此，笔者有理由推断：延缓或逆转这一过程可有效降低颅内动脉瘤的破裂。

3 循环血EPCs缺陷介导的血管自身修复能力下降是影响颅内动脉瘤破裂的关键因素

“过度炎症反应学说”主要强调血管损伤因素，但受损状态下，体内血管自身修复机制在颅内动脉瘤形成与破裂过程中的作用尚未得到足够重视。内皮损伤后，血管新生介导的血管损伤后内皮修复能力也是影响颅内动脉瘤破裂的关键因素之一。笔者所在课题组既往的研究显示[4]，颅内动脉瘤患者循环血EPCs数量减少、迁移能力下降和衰老比率增加。研究组借助Hashimoto大鼠颅内动脉瘤模型发现，颅内动脉瘤大鼠外周血EPCs呈逐渐下降的趋势。利用EPO[5]提高EPCs可以有效地降低颅内动脉瘤的形成、延缓进展以及降低其破裂风险。通过蛋氨酸饮食[6]降低大鼠循环血EPCs可以有效提高颅内动脉瘤的形成、加速进展以及增加其破裂风险。阿托伐他汀可以通过促进血管新生来延缓颅内动脉瘤的进展，降低破裂风险[7-8]。国内的研究[9]证实，瑞舒伐他汀可以增强EPCs的功能，促进动脉瘤颈部内皮修复。基于上述研究，笔者分析：(1)EPCs缺陷所致的受损血管自身修复能力下降在颅内动脉瘤形成、进展与破裂过程中的作用十分重要；(2)EPCs缺陷增加了颅内动脉瘤破裂的风险；(3)增强EPCs介导的血管新生，可以促进IAs内血管损伤部分的内皮修复，在延缓颅内动脉瘤进展以及降低破裂风险方面发挥作用。

4 人脐血EPCs移植可以降低颅内动脉瘤破裂风险，为未破裂颅内动脉瘤的治疗提供新思路

近年来，EPCs移植治疗颅内动脉瘤的研究逐步得到国内外专家们的重视。研究证实，移植骨髓源性EPCs可以加速动脉瘤内皮增殖、瘤腔纤维化以及动脉瘤颈的愈合，加速动脉瘤修复[10]。Aronson JP等[11]在兔动脉瘤研究中发现， EPCs移植治疗可促使动脉瘤腔内完整内皮层的形成，参与动脉瘤瘤颈部位损伤内皮的自身修复。Li ZF等[12]利用猪胰弹性蛋白酶浸泡兔右颈总动脉，诱导形成颈总动脉瘤，并将血管导向装置植入动脉瘤，研究表明EPCs可参与动脉瘤腔的修复和新生内膜形成。笔者所在课题组前期研究[13]显示：移植人脐血EPCs可以促进血管新生，阻断内皮功能障碍，延缓了动脉瘤性血管壁退行性改变，起到了血管保护作用，对降低动脉瘤破裂风险有治疗作用。课题组借助同种大鼠EPCs移植及示踪实验，利用FISH法观测到循环血EPCs可以归巢定位至动脉瘤形成部位，获得EPCs介导的血管新生参与颅内动脉瘤形成、进展至破裂的直接证据。同时还发现：内皮祖细胞分泌的细胞因子可促进EPCs的迁移和归巢，参与损伤血管的修复。以上研究结果表明：静脉移植人脐血EPCs可以促进动脉瘤瘤颈部损伤内皮的自身修复，延缓动脉瘤的进展，降低了动脉瘤破裂的风险，可有望成为未破裂颅内动脉瘤预防性治疗的理想干预手段，为未破裂颅内动脉瘤的治疗提供新思路。

5 人脐血EPCs来源外泌体(EPC-Exos)在降低颅内动脉瘤破裂方面的作用及应用前景

EPCs移植应用于预防UIAs破裂存在诸多的风险和不足，如干细胞致瘤性、免疫排斥反应以及病原微生物污染等。这些问题成为制约其临床应用的瓶颈，成为干细胞研究中一大障碍。这也是我们亟待解决的核心和关键问题之一，寻找一种能替代EPCs并回避这些风险和不足的新疗法具有深远的意义。近年来的研究证明：直接应用干细胞来源的外泌体治疗，可以避免直接应用干细胞带来的一系列风险，具有非常广阔的应用前景。EPCs来源的外泌体(EPC-Exos)作为一种细胞微环境内的介质，可以在细胞与细胞间的沟通中调节内皮细胞的功能。EPC-Exos从EPCs分泌后，通过其内富含的蛋白质、mRNA和miRNA来调控血管新生，促进内皮细胞的再生，稳定血管内微环境稳态，从而增强损伤内皮的自身修复能力。近年来，Li X等[14]用内皮祖细胞来源外泌体(EPC-Exos)分别处理颈动脉损伤和糖尿病大鼠，结果发现EPC-Exos处理后，血管内皮细胞的增殖和迁移能力均明显增强，提示EPC-Exos能够促进血管新生，修复损伤的血管内皮细胞。也有学者发现EPC-Exos通过增强血管新生，促使成纤维细胞向内皮细胞的分化，抑制心肌纤维化，从而改善心肌梗死患者的心功能。上述研究提示： EPC-Exos介导的血管新生在血管损伤后内皮修复过程中发挥重要作用。

外泌体在中枢神经系统疾病中的研究多集中于脑胶质瘤、神经退行性疾病、神经系统自身免疫性疾病、颅脑损伤、脑出血及脑梗死等，而EPC-Exos在颅内动脉瘤发病机制及治疗中的作用鲜有报道。近年来，国内外学者开始关注外泌体在腹主动脉瘤发病机制及治疗中的作用。Yamawaki-ogata等[15]在腹主动脉瘤的动物实验中发现，输注间充质干细胞来源的外泌体(MSC-Exos)通过降低血管壁的局部炎症，促进损伤血管的内皮修复，可以延缓腹主动脉瘤的进展以及阻止其破裂，成为用于预防腹主动脉瘤破裂的非手术治疗方式之一。在近期的预研究中，笔者已成功地从未破裂颅内动脉瘤患者外周血分离和提取EPC-Exos。为探讨EPC-Eoxs在颅内动脉瘤破裂中的作用，笔者借助C57BL/6J颅内动脉瘤小鼠，发现经尾静脉输注人脐血EPCs来源外泌体(EPC-Exos)可以降低动脉瘤的破裂率，初步显示EPC-Exos可以降低颅内动脉瘤的破裂。由此可见：EPC-Exos可以延缓颅内动脉瘤的进展，阻止颅内动脉瘤的破裂，在降低UIAs破裂方面具有广阔的临床应用前景。

6 EPC-Exos可能通过miRNA-126-3p抑制靶基因SPRED1降低颅内动脉瘤破裂

miR-126是促进血管新生的miRNA，在维持血管结构和稳定血管内皮细胞功能上发挥重要作用。 Wang S等人敲除小鼠体内miR-126后发现，miR-126的降低可致血管形成障碍以及血管壁破坏，而过表达的miR-126可以通过抑制SPRED1而促进血管形成，从而阐明miR-126对于维持血管结构的重要性。而且，miR-126在干细胞外泌体治疗中发挥重要作用[16]，研究显示：miR-126过表达的滑膜间充质干细胞外泌体可以促进损伤皮肤的修复。miR-126过表达的脂肪干细胞外泌体可以通过减少细胞凋亡、缓解局部炎症、逆转心肌纤维化以及促进血管新生而发挥其保护心肌细胞的作用，以减轻心肌损伤，从而改善心肌梗死的预后[17]。miR-126-3p高表达的CD34阳性干细胞分泌的外泌体(CD34-Exo)可以促进小鼠下肢缺血模型的血管生成。以上研究提示：miR-126是干细胞来源外泌体富含或分泌的与血管新生有关的microRNA，能促进内皮细胞的再生，并参与血管损伤后的内皮修复。笔者在前期研究中，将获得的人脐血EPCs来源外泌体(EPC-Exos)进行miRNA高通量芯片检测，筛选EPC-Exos与单个核细胞来源的外泌体(MNC-Exos)之间差异表达的miRNA，发现：人脐血EPC-Exos中miRNA-126-3p高表达。基于上述结果笔者推断：(1)人脐血EPC-Exos富含miRNA-126-3p；(2)EPC-Exos降低颅内动脉瘤破裂风险与其富含miRNA-126-3p有关。

已有文献报道，miR-126-3p能够通过调控SPRED-1、SDF-1、VCAM-1、HoxA9、v-Crk、EGFL-7和VEGF等基因的表达，调节血管发育、新生血管形成以及血管炎症反应等病理生理过程。在动脉硬化[18]的研究中显示：miR-126-3p作用于 SPRED-1位点，抑制SPRED-1，增强Raf1/ERK通路，促进血管新生及内皮细胞增殖。此外，在CD34-Exos治疗肢体缺血的实验研究中也发现，miR-126-3p可以抑制靶基因SPRED1的表达来促进血管新生；SPRED1同时还调控血管新生相关因子的表达，如VEGF、ANG1、ANG2、MMP9、TSP1等。SPRED1是RAF/MAPK/MEK/ERK信号通路的抑制基因，对细胞生长和分化起重要作用。在血管内皮细胞中，它是血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的负性调节因子。在既往的研究中，笔者也进行了miR-126-3p靶基因的分析和预测，并推测SPRED1是miR-126-3p的靶基因，可以激活下游VEGF/RAF/MEK/ERK/VEGF信号环路。

7 展望

上述问题是我们参考国内外研究，并结合笔者所在课题组研究成果基础上做出的归纳总结，具体结果尚需要通过进一步的研究证实。今后我们将从临床和基础两方面着手进行研究，努力探索内皮祖细胞来源的外泌体降低颅内动脉瘤破裂的机制，并验证我们提出的假说，如下：EPCs来源外泌体通过miR-126-3p抑制靶基因SPRED1，促进血管新生，预防颅内动脉瘤破裂。综上所述，预期结果及假说的提出将进一步完善颅内动脉瘤进展与破裂的病理生理学机制，基于结果，提出应用EPC-Exos治疗未破裂颅内动脉瘤的创新策略，为临床转化奠定基础。