免疫胶体金技术在临床检测领域的应用进展

王 劭

（钦州市灵山县人民医院检验科，广西 钦州 535400）

胶体金又被称为金溶胶，是指在柠檬酸三钠等还原剂的作用下，将金盐还原成金后所形成的金颗粒悬液。胶体金具有大小均匀的特点，在静电作用下会处于稳定状态。免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique）是以胶体金作为示踪标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜、电镜下对抗原或抗体进行定位、定性、定量检测的一种新型检测技术。近年来，免疫胶体金技术在临床检测领域得到了广泛应用。本文就免疫胶体金技术在临床检测领域的应用进展进行综述。

1 免疫胶体金技术的概述

1971 年Faulk 和Taytor 将胶体金引入到免疫化学领域。此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学检测方法，在生物医学领域得到了日益广泛的应用。近年来随着现代医学技术的进步及多克隆抗体技术、单克隆抗体技术的逐渐成熟，免疫胶体金技术逐渐得到发展和完善。目前，免疫胶体金技术被临床上广泛应用于肿瘤检测、心血管疾病的临床诊断、免疫系统评估等领域，并发挥着重要作用。近年来随着临床检测技术的不断完善与发展，一些学者开始尝试将免疫胶体金技术与免疫比浊法、斑点渗透法等相结合，应用于临床检测工作中。将上述几种检测技术有机结合后，能够实现对血药浓度、细胞因子、蛋白质等涉及复杂生物活性的半定量或定量检测，且具有检出率高、检测的速度快等优势。在采用免疫胶体金技术进行临床检测时，不需要使用昂贵的仪器和设备，且对检测人员工作经验的要求不高，这为该技术的推广应用奠定了良好的基础[1]。

2 免疫胶体金技术的应用现状

2.1 电镜标记技术

从免疫胶体金技术早期的应用情况来看，该技术最早被广泛应用于扫描电子显微镜镜检中。胶体金颗粒具有高电子密度及球形外观等特点，将其应用于扫描电子显微镜镜检中能够精准地发现粪便幽门螺杆菌抗原等物质。在检测期间，因为制备方法的不同，会导致胶体金颗粒的大小存在差异。通常情况下，胶体金颗粒的直径为20 ～150 nm，但也有少数胶体金颗粒的直径为3 ～19 nm。正是由于胶体金颗粒直径的不同，在扫描电子显微镜镜检中应用免疫胶体金技术才能更好地实现单标记、双标记及多标记等功能，并显示出不同的抗原。有学者制备了血小板膜糖蛋白，在采用不同粒径的胶体金对血小板膜糖蛋白进行标记后，经微波固定的方式有效地将胶体金探针定位到血小板表面及其内部的膜糖蛋白上，取得了令人满意的效果。赵艳秀等[2]认为，采用免疫胶体金技术进行定性检测、半定量检测与定量检测能显著提高检测的效率，具有先进性。

2.2 斑点免疫金渗滤技术

斑点免疫金渗滤技术最早出现于20 世纪80年代，是在固相免疫测定法的基础上发展而来的一种新型检测技术。作为一种初筛的检测手段，斑点免疫金渗滤技术能满足多种疾病的临床检测要求。有研究指出，采用斑点免疫金渗滤技术进行粪便隐血检测能提高诊断的灵敏度，且该技术的抗干扰能力与传统的邻甲苯胺法相比更具有优势[3]。有学者对斑点免疫金渗滤技术进行了横向比较，分别采用流式微球载体技术（flow microbeads assay，FMA）、酶联免疫吸附法和斑点免疫金渗滤技术检测血清梅毒抗体，结果显示，用这三种技术检测血清梅毒抗体的特异性均为100%，用FMA、酶联免疫吸附法、斑点免疫金渗滤技术检测血清梅毒抗体的灵敏度分别为100%、96%、94%[4]。由此可见，斑点免疫金渗滤技术在血清梅毒抗体检测中可发挥重要的作用。该技术将胶体金作为标记物，在不影响蛋白质活性的前提下能够依托其稳定的性质来完成有效检测，具有检测的速度快、效率高等优点。

2.3 胶体金免疫层析技术

免疫层析技术是一种免疫检测技术，其特点是应用抗原- 抗体免疫学反应和层析反应，可快速、准确地完成相应的检测工作。早在20 世纪90 年代，有学者就在免疫胶体金技术的基础上进行改进，找到了一种更加便捷、高效的检测技术，即胶体金免疫层析技术。有学者以胶体金为标记物制备赤霉素单克隆抗体- 胶体金偶联物，以竞争抑制模式制备赤霉素胶体金免疫层析试纸条，用该试纸条对豆芽中的赤霉素进行检测，结果显示，用该试纸条对豆芽中的赤霉素进行检测的检出限为100 μg/kg，灵敏度为98%，特异性为97%，假阴性率为2%，假阳性率为3%[5]。有学者对胶体金免疫层析法在临床检测领域的应用优势进行了分析，总结其优势为：1）可提高诊断的灵敏性。例如，在采用胶体金免疫层析法对蛋白A 抗体进行检测时，样品在经过狭窄的硝酸纤维素膜后能将被检测物质浓缩，因此可显著提高检测效率和诊断的灵敏性。2）可提高诊断的特异性。在采用胶体金免疫层析技术进行临床检测时通常选择纯品为抗原，可提高诊断的特异性。另外，检测时所用胶体金颗粒的直径越小，检测的效果越好[6]。3）具有很好的稳定性与可重复性。4）被胶体金标记的样品在4℃的环境中可储存2 年以上，且无信号衰减的现象。在采用胶体金免疫层析技术进行临床检测时，胶体金的稳定性是影响最终检测结果的关键。近年来随着胶体金制备工艺的逐渐成熟（例如优化了胶体金标记的最佳条件和胶体金颗粒悬浮的最佳配方等），胶体金的稳定性得到了显著提升。此外，随着胶体金免疫层析技术的不断完善，一些学者开始将该技术应用于疫情检测工作中。梁秋光等[7]利用胶体金免疫层析技术对含鼠疫的45 份阳性血清进行检测，最终的检测结果显示，这45 份样品的检测结果均呈阳性。

3 免疫胶体金技术在半定量与定量检测中的应用

胶体金本身的颜色以粉红色、红色为主。通常情况下，采用光学传感器或在肉眼下可直接观察到胶体金颜色的变化，故通过免疫胶体金技术可实现半定量及定量检测。

3.1 免疫胶体金技术在半定量检测中的应用

在免疫胶体金技术出现后不久，就有学者尝试采用该技术进行半定量检测。采用免疫胶体金技术进行半定量检测的依据是：硝酸纤维素膜的显色面积与抗体浓度呈正相关。有学者建立了一种伴有质控点的免疫金渗滤技术，用于半定量检测人尿中的微量白蛋白，结果证实，用该技术半定量检测人尿中微量白蛋白的结果可靠，且方便快捷，特别适合中、小医院和门诊使用[8]。

3.2 免疫胶体金技术在定量检测中的应用

现代医学技术的发展带动了免疫胶体金技术的变革。当前，不少医院在临床检测工作中开始大面积推广使用胶体金免疫定量检测仪。该仪器的出现进一步提高了免疫胶体金技术的检出效率，并推动了定量检测技术的完善与发展。采用免疫胶体金技术进行定量检测的原理是：将硝酸纤维素膜上检测线的颜色变化及待测物质浓度的线性比例与标准曲线进行对比，可获得最终的定量分析结果[9]。胶体金试剂条对于不同物质的显色过程是动态变化的，且试剂条的生产工艺、质量标准等都会导致检测结果出现变化。近年来临床上在采用免疫胶体金技术进行定量检测时，为了能够进一步提升检测结果的精准度，开始尝试使用一种新的定量检测方法，即T/C（检测线/ 质控线）法。与采用传统的免疫胶体金技术进行定量检测相比，采用T/C 法进行定量检测有助于降低温度、时间等外部因素对最终检测结果的影响[10]。

4 免疫胶体金技术与新技术的结合

4.1 免疫胶体金技术与鲁米诺检测技术的结合

鲁米诺又叫发光氨，是一种化学荧光分子，其被单氧氧化后可发出蓝光并被肉眼所察觉。鲁米诺试剂可以显现出极微量的血迹形态（潜血反应），故鲁米诺检测技术被广泛应用于刑事侦查、生物工程、化学示踪等领域。有学者在鲁米诺探针的基础上开发出了具有良好响应特性的单探针，经鲁米诺的还原作用成功制备了双响应鲁米诺还原胶体金，最终的试验结果证实，双响应鲁米诺还原胶体金可在静电相互作用下标记抗体[11]。有学者建立了小鼠实验模型，对鲁米诺还原胶体金的检测价值进行研究，结果证实，使用鲁米诺还原胶体金能够更快速地完成对蛋白质的检测，且胶体金中的发光体所产生的化学发光信号能够达到定量检测的要求；化学发光信号的线性范围为0.1 ～100 ng/mL，检出限为0.033 ng/mL，与传统检测技术相比检出限更低；从成本方面来看，应用鲁米诺还原胶体金时由于不需要使用复杂的光学仪器，故其在价格上也具有优势[12-13]。

4.2 免疫胶体金技术与表面增强拉曼光谱技术的结合

表面增强拉曼光谱（surface-enhanced raman spectra，SERS）与红外光谱同属于分子振动光谱，可反映分子的特征结构。SERS 技术具有超敏感性和非破坏性的特点，是一种新型的生物检测技术。与传统的生物检测技术相比，SERS 技术可为生物检测提供全面的“分子指纹”，能够用于检测样品中的固有信号。SERS 技术的检测原理是：在应用该技术时，可将待测分子吸附在粗糙的纳米金属材料表面，使待测物的拉曼信号增强多达14 个数量级，这不仅能完成特定范围内的分子检测，还能用于单个根元素的检测[14]。针对该技术的优势，目前医学界开发出了一种新型的免疫探针，由拉曼探针分子、新霉素单克隆抗体和双标记胶体金组成。该免疫探针可获得更强的拉曼信号，能在短时间内完成临床检测，且检出限低至0.285 pg/mL，明显低于常规免疫胶体金技术2.73 ng/mL 的检出限[15]。

5 小结

在临床检测领域，免疫胶体金技术具有广阔的应用前景。免疫胶体金技术通过与诸多先进的临床检测技术相结合，能够充分满足复杂条件下临床检测的需求，这也是未来临床检测领域发展的新方向。