基于组织芯片技术分析间皮素在人胆囊癌组织中的细胞定位及意义

倪庆强，高恒军，杨发基，刘方峰，朱化强，李洪光，周旭，常宏，卢俊

山东第一医科大学附属省立医院肝胆外科，济南250021

胆囊癌是常见的消化道恶性肿瘤，根治性切除手术是目前惟一可能获得治愈机会的治疗手段。胆囊癌起病隐匿，常因胆石症行胆囊切除手术中意外发现[1]，但仅约10%的患者有根治性切除手术机会[2]。由于胆囊解剖位置毗邻第一肝门，借胆囊床与肝脏相连，早期易发生淋巴结转移，手术时获得组织学阴性切缘较为困难，且放化疗效果不佳，致使胆囊癌患者生存期短、预后极差。因此，迫切需要研究新的治疗方法及治疗靶点。间皮素是一种仅表达于机体间皮细胞的蛋白质，迄今其生物学行为仍未得到详细阐明。研究表明，间皮素不同的细胞定位与其生物学行为密切相关。近年来，间皮素已逐渐成为卵巢癌、胸膜间皮瘤、胰腺癌等实体瘤靶向治疗的热点之一。然而，在胆囊癌研究领域关于间皮素的报道较少。2017年1月—4月，我们采用组织芯片技术检测间皮素在胆囊癌和癌旁正常胆囊组织中的细胞定位情况，旨在进一步探讨其作为诊断标志物和治疗靶点的潜在价值，为提高胆囊癌诊治水平提供参考。

1 材料与方法

1.1 组织标本来源 制备组织芯片所需胆囊癌及癌旁正常胆囊组织均购自上海芯超生物科技有限公司，其中胆囊癌组织和癌旁配对正常胆囊组织各20例份、单独胆囊癌组织60例份，经病理医生二次复检确诊。80例胆囊癌患者中，男24例、女56例，年龄31～84(64.36±10.88)岁，病理类型为腺癌69例、腺鳞癌8例、鳞状细胞癌3例，患者术前均未行化疗、放疗和或靶向药物治疗等抗肿瘤治疗。

1.2 组织芯片制备 将20例份胆囊癌及癌旁正常胆囊组织各1位点、单独60例份胆囊癌组织各1位点，顺序排于空白受体蜡块上，分布于同一张组织芯片(上海芯超生物科技有限公司，型号HGal-Ade100PG-01)共100位点，然后编号(图1)。将组织阵列芯块放置于50～52 ℃烘箱保温，制成组织芯片蜡块，修整蜡块以备切片。将组织芯片的蜡块以4 μm厚连续切片，附于载玻片上，放置于60 ℃烘箱烘烤16 h。按照编号每间隔50张，抽取1张组织芯片切片行HE染色；病理医生根据HE染色组织形态进行质控，确保目标组织的有效位点达90%以上。将做好的组织芯片实验用白片放置于切片盒中，4 ℃冰箱冷藏保存。

注：浅色为肿瘤组织芯片位点，深色为癌旁正常组织芯片位点。

1.3 胆囊癌和癌旁正常胆囊组织中间皮素检测 采用免疫组化法，单克隆兔抗人mesothelin抗体购自Abcam公司。将石蜡切片进行常规脱蜡和水化，对内源性的过氧化物酶进行灭活处理。将脱蜡水化后的组织芯片放置于耐高温的塑料切片架上，放入含有足量0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)的压力锅中；煮沸加热至压力阀喷气后2 min，再以PBS洗涤3次。为避免结果出现假阳性，切片上的其他抗原位点非特异性地与一抗结合，可用正常的山羊血清封闭液，室温封片1 h；甩去血清，滴加1∶1 000稀释的一抗，4 ℃孵育过夜。二抗处理后室温孵育30 min，用PBS洗涤3次(每次5 min)。滴加DAB反应2 min，显微镜下观察显色反应，再用苏木素染液复染2 min。将切片按照乙醇浓度70%、85%、100%依次浸泡2 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ依次浸泡各5 min。全部透明后封片，晾干切片，显微镜观察染色情况。

1.4 间皮素检测结果判定 在显微镜下，间皮素阳性染色为棕黄色或棕褐色。染色强度评分：无染色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分。阳性染色细胞所占比例：阳性细胞占比<1%计0分，阳性细胞占比1%～<10%计1分，阳性细胞占比10～<50%计2分，阳性细胞占比≥50%计3分。每张切片随机选取不同代表性区域观察，高倍镜下共观察5个视野。将染色强度与阳性细胞占比评分相乘得出总分，取平均值。所有结果由两位病理学专家在不知临床病理资料双盲情况下独立观察，当意见不同时，详细讨论后达成一致结果。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料行正态性检验，非正态分布的计量资料用M(Q)表示，两组数据比较采用非参数秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

胆囊癌组织细胞膜中间皮素表达高于癌旁正常胆囊组织(P<0.05)，而在细胞质、细胞核中两者间皮素表达差异无统计学意义。见表1。典型胆囊癌、癌旁正常胆囊组织间皮素检测结果见图2、图3。

表1 胆囊癌和癌旁正常胆囊组织不同细胞定位的间皮素表达情况比较[M(Q)]

注：A为胆囊癌组织间皮素细胞质阳性率90%、细胞膜阳性率15%、细胞核阳性率0；B为胆囊癌组织间皮素细胞质阳性率90%、细胞膜阳性率15%、细胞核阳性率80%；C为胆囊癌组织间皮素细胞质阳性率100%、细胞膜阳性率90%、细胞核阳性率100%；D为胆囊癌组织间皮素细胞质阳性率100%、细胞膜阳性率20%、细胞核阳性率60%。

3 讨论

临床上胆囊癌发病率虽不如其他消化道肿瘤发病率高，但其恶性程度高，5年生存率极低，往往发现时已进展至中晚期，失去手术切除治疗的机会。

因此，临床迫切需要找到新的指标作为胆囊癌早期诊断标志物和治疗靶点。

目前，关于间皮素正常功能的研究较少。研究发现，间皮素敲除的小鼠在生长发育、生殖及造血功能方面均与正常小鼠类似，认为间皮素可能并不是人体生长发育所必须。尽管间皮素在正常机体中分布局限，但其在许多肿瘤中都有表达。现有研究发现，间皮素在卵巢癌、胸膜间皮瘤、胰腺癌及三阴性乳腺癌等肿瘤组织中均有表达，肿瘤组织与正常组织中间皮素存在差异性表达。另外，间皮素还可以促进肿瘤的增殖、局部侵犯、转移以及化疗抵抗[3-8]。如在胰腺癌细胞系中，间皮素可激活PI3K/AKT及NF-κB信号通路，并上调IL-6/Mcl-1表达，从而抑制TNF-α诱导的细胞凋亡[9]；间皮素还可促进基质金属蛋白酶(MMP)7和MMP9分泌，促进胸膜间皮瘤、胰腺癌细胞的迁移和侵袭[3,10]；间皮素可与卵巢癌细胞表面的CA-125相结合，增强细胞间的黏附，进而促进卵巢癌细胞转移[11]。此外，临床观察性研究结果表明，间皮素高表达与肿瘤的更高级别、更晚分期及不良预后相关[12-13]。间皮素的上述特点，使其有望成为肿瘤相关抗原特异性诊断和靶向治疗的理想分子。

本研究在间皮素的检测方法方面，选用组织芯片技术。与传统病理石蜡切片相比，组织芯片技术将多个病理切片进行筛选、打孔等处理后固定于同一蜡块上进行平行分析，可使实验条件尽可能一致，大大降低实验成本。本研究结果显示，与癌旁正常胆囊组织相比，胆囊癌组织细胞膜间皮素表达增高。这表明间皮素可能通过增强肿瘤细胞的黏附力使肿瘤细胞聚集形成癌转移灶，从而在胆囊癌浸润、转移过程中发挥作用。FRIERSON等[14]研究了150例不同组织间皮素表达情况，发现间皮素基因在胰腺癌细胞和卵巢癌细胞中高表达，而在前列腺、膀胱、输尿管、肝脏、肾脏、甲状腺组织中不表达或极低表达，进一步提示间皮素具有作为胆囊癌特异性诊断指标与治疗靶点的潜能。胆囊是人体非必需器官，适合作为生物免疫靶向治疗靶器官，针对间皮素相关免疫靶向治疗方面已有些研究成果[15-18]。本研究应用组织芯片技术进行免疫组化实验，从胆囊癌细胞定位角度阐明间皮素在胆囊癌组织中高表达，将为进一步研究间皮素促进胆囊癌发生发展相关机制及其生物学行为提供参考。本研究后续将围绕间皮素基因敲除后对胆囊癌发生、发展的影响开展工作，以期为胆囊癌的早诊、早治奠定基础。