斑马鱼模型的毒理学研究进展及其在法庭科学中的应用前景

李亦凡，程亦斌，田志岭，刘宁国

1.复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063

斑马鱼是一种原产于南亚河流的小型热带鱼，因体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。斑马鱼作为模式生物的优点主要是易于饲养、操作、观察和分析，研究结果具有很大参考价值，现已成为发育生物学、生物遗传学和分子生物学等研究领域的理想模型，也是进行药物筛选、疾病研究和生态环境评价等的模型生物之一。作为一种理想的动物模型，斑马鱼既可用于行为学观测，也可观察器官变化和免疫反应，还可分析毒（药）物在体内吸收、代谢、分布的整个过程，因此其在法医毒理学和环境损害司法鉴定等研究中必有广阔的应用前景。本文从斑马鱼的生物学特性出发，总结斑马鱼模型的毒理学研究进展，展望其在司法鉴定中的应用前景。

1 斑马鱼的生物学特性

在毒理学研究中，斑马鱼是一种非常适合用于观测外源化学物及其代谢物对生物体损伤作用规律以及在体内代谢分布的脊椎动物模型。斑马鱼具有体积小、发育快、繁殖力强、哺育周期短的特点，饲养简便且经济；胚胎透明，对不利生存环境敏感，易于进行多种实验处理，便于操作和观察分析[1]；已知基因组和分子信息丰富，与人类基因组具有高度同源性，生物合成通路与人类相似，故斑马鱼模型研究获取的结果与人体检测数据的可融合性高，具有很大的参考价值[2]。因此，斑马鱼成为目前国内外学者认可的理想的毒理学动物研究模型。

斑马鱼模型中常作为实验对象的有胚胎、仔鱼和成鱼。斑马鱼胚胎由亲代产卵得到，用于进行发育毒性试验，毒物暴露处理后常以卵凝结、孵化延迟、形态畸形等致死、致畸效应作为观测终点[3]。胚胎孵化96～120 h 后斑马鱼可以自由运动、自主取食，因此该阶段多以行为作为评价指标进行毒性试验[4]。达3 月龄的斑马鱼属于成鱼，体内各组织器官和内分泌系统已发育完毕，可进行多种生物标志的观测，还可以取出体内的器官来评价外源物质对不同组织器官的影响[5]。

近年来，随着转基因技术的发展和斑马鱼基因组测序的完善，越来越多的转基因系斑马鱼被投入应用。如WHITE 等[6]建立的去除条纹的透明成年鱼，此转基因系克服了成年斑马鱼因有条纹而不便于直接观察的不足，可以裸眼或通过立体显微镜观察成年斑马鱼体内组织器官在外源物质影响下的改变；BLECHINGER 等[7]建立了可监测水环境中低浓度镉污染的转基因系，以热激蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）启动子为反应元件，驱动绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的表达，检测浓度可低至0.2 μmol/L。相较于野生型斑马鱼，利用转基因技术获得的实验结果在灵敏度和特异性方面都有了较大提升，既提高了低浓度范围的监测稳定性，又提升了专一物质检测的特异性，同时使实验器材的设计、操作和后续数据分析更为便利，节省了人力、物力、时间，也更加注重生态环保。

2 斑马鱼的毒理学研究进展

斑马鱼用于毒理学研究的基本模式：第一步，监测毒物种类和浓度；第二步，评估斑马鱼的生物学行为并获得数据；第三步，解释所得现象和数据；第四步，证实第三步中的解释。实现了从生物学行为到分子机制的解释与证实后，该行为和分子就可以作为终点（endpoint）和生物标志（biomarker）应用于后续的监测，该研究模式是各领域进行研究的基础思路[8]。

进行斑马鱼模型的实验设计时，在毒物暴露的斑马鱼发育阶段[9]、暴露持续时间、暴露途径[10]、毒物浓度各方面均需针对性设计和选择，实验中水环境的营造即鱼类共同的直接暴露介质，也有纯净配制溶液或废水、污水之分[11]，终点和生物标志的范围也很广泛，涵盖外观、行为、代谢、分子结构等多层次[12]，每一层次又有大量的可观测指标[13]。例如ZHANG 等[2]在研究手性布洛芬（ibuprofen，IBU）立体选择性效应的实验中，将成年斑马鱼分组后，在玻璃鱼缸内暴露于以丙酮为溶剂、环境相关质量浓度为5 μg/L 的消旋布洛芬（rac-IBU）、左旋布洛芬［R-（-）-IBU］和右旋布洛芬［S-（+）-IBU］中，处理周期为28 d。暴露结束后取出斑马鱼脑组织，利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技术分析脑组织的脂质代谢物。实验的最终目的是建立毒物与机体的交互作用流程图，从相互作用机制的不同环节出发，获得所需信息，应用于毒物监测、环境保护、健康治疗等领域。再如RAMESH 等[14]在研究有机磷阻燃剂（organophosphorus flame retardant，OPFR）磷酸三苯酯（triphenyl phosphate，TPhP）对水生生物潜在毒性影响的实验中得出，饲养环境中的TPhP经斑马鱼吸收后，于肝组织进行生物转化，在体内起毒性作用的物质是TPhP 及其代谢物磷酸二苯酯（diphenyl phosphate，DPhP），毒性作用的靶器官为脑和肝。在肝毒性方面，TPhP 造成了肝糖原蓄积和能量代谢紊乱。造成糖原蓄积的原因为肝生物代谢产物干扰信号传递导致葡萄糖代谢受影响，造成能量代谢紊乱的主要机制为肝组织中线粒体膜功能失调。在神经毒性方面，TPhP 抑制脑组织胆碱酯酶活性，作用机制与TPhP 长期蓄积造成的氧化应激相关。

2.1 急性毒性

急性毒性是指一次或24 h 内多次接触较大剂量外源化学物后机体短期内出现的毒性效应。致死效应、发育毒性、行为异常和生命体征是斑马鱼模型中急性毒性的常用观测终点，其中生命体征可以通过监测呼吸和心率进行观测。利用斑马鱼研究水草控制剂二甲戊乐灵对非水草水生生物危害的实验[15]发现，实时呼吸监测可以有效反映农药对斑马鱼胚胎能量代谢的抑制，尤其是其对线粒体电子传递链复合体Ⅰ和Ⅴ的影响，从而反映其急性毒性。针对污水处理厂排出水的生态影响的研究[11]证实，幼体斑马鱼的心率监测可作为监控污水处理厂排出水处理效果的指标。

2.2 慢性毒性

慢性毒性是因长期接触低浓度外源化学物而逐渐产生的毒性作用，在动物实验中指在其正常生命周期的大部分时间内接触化学物所引起的健康损害效应。慢性毒性实验能够更为真实地模拟环境中化学物质对生物体的毒性作用，研究结果在环境污染治理和非事故性损伤鉴定中具有更大的应用价值。

2.2.1 行为学改变

行为学改变作为观测终点具有可观测项目多、操作简便的优势，但行为反应的高度复杂性也使得目前缺乏行为实验操作和评估的规范标准，以致对于结果有效性的评价成为难点。含有草甘膦成分的农药对水环境生态影响的实验[16]结果显示，环境相关质量浓度（0.3、3 μg/L）草甘膦的长时间（2 周）接触可导致成年斑马鱼的探索行为减少、社交行为改变，进一步对斑马鱼的生存产生不利影响。水环境中地西泮残余物对斑马鱼行为干扰的研究[17]结果显示，将成年斑马鱼暴露于12 μg/L 和120 μg/L（均处在亚致死浓度范围内）的地西泮21 d 后，雌性、雄性斑马鱼的求偶相关实验行为均受到显著影响。

2.2.2 致畸效应

在二氧化钛纳米微粒（titanium dioxide nanoparticle，nano-TiO2）神经毒性机制的研究[18]中，斑马鱼胚胎对梯度质量浓度（0.01、0.1、1.0 mg/L）微粒的暴露结果显示，微粒处理会对斑马鱼胚胎运动神经元轴突的生长产生不利影响，实时聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）显示微粒暴露处理影响了神经元发生和轴突生长的相关基因表达，且高浓度微粒可降低斑马鱼仔鱼的身长和体质量。在斑马鱼胚胎的致畸效应与哺乳动物致畸效应相关性研究[19]中，斑马鱼胚胎对于丙戊酸及其9 种类似物的暴露结果显示，其中4 种物质的亚致死剂量暴露可导致斑马鱼的小眼和颅面畸形，这与哺乳动物的神经管缺陷具有相关性。

2.2.3 内分泌干扰毒性

甲状腺是机体激素调节的重要枢纽，下丘脑-垂体-甲状腺轴（hypothalamic-pituitary-thyroid axis，HPTA）更是维持机体稳态的重要因素。抗生素土霉素（oxytetracycline，OTC）的毒性研究[20]证实，环境浓度OTC 可使成年斑马鱼血浆中三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）水平显著增高。关于可用于生产塑料杯的双酚芴对HPTA 影响的研究[21]结果显示，双酚芴可通过影响HPTA 相关基因的表达从而影响甲状腺激素水平。

2.2.4 神经毒性

神经毒性的产生可由神经元受损或神经传导通路中任一环节的异常导致。LAM 等[1]将斑马鱼胚胎暴露于800 μmol/L 的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP），2 d 后对斑马鱼进行脑组织原位杂交检测，发现斑马鱼胚胎对MPTP 的暴露会特异性损伤多巴胺能神经元。马兜铃酸的神经毒性实验[22]结果显示，斑马鱼胚胎持续暴露于非致畸浓度（≤4 μmol/L）的马兜铃酸可导致幼体斑马鱼视觉感受相关基因表达受损。在三丁基锡对鱼类焦虑行为的干扰及其可能机制的研究[23]中，成年雄性斑马鱼暴露于100、500 ng/L 三丁基锡28 d 后，水箱行为测试结果显示三丁基锡的处理提高了斑马鱼的焦虑感，该研究指出这可能与血浆皮质醇浓度的提高，5-羟色胺、多巴胺、γ-氨基丁酸神经递质系统中与递质的合成和活化有关的基因表达下调有关。

3 斑马鱼在法庭科学研究中的应用前景

法庭科学是利用不同领域的基础研究成果进行鉴定的应用科学，主要目的在于通过识别、评估、追踪和溯源为侦察提供线索或为审判提供依据，为法庭证据科学化服务。斑马鱼模型在基础科学、环境科学和毒理学研究中已有大量应用，作为一种成熟、高效、便捷的毒理学研究模型，随着各项研究的开展和深入，斑马鱼模型未来在法庭科学中必然有广泛的应用前景。

3.1 环境损害司法鉴定

环境损害司法鉴定是一门新兴的司法鉴定门类，虽然大多数技术可以直接借鉴环境科学的研究方法和成果，但作为法庭证据，必然在法律意义上更为严谨。当前，斑马鱼模型水环境毒理学研究成果在环境污染事件监测、追踪以及对污染区域动植物、人群健康评估方面，可提供科学数据支撑。

3.1.1 水环境重金属元素的毒理研究

重金属污染物的常见类别有金属单质（如铝、硒、碲）、氧化物（如二氧化钛）、甲基化物（如甲基汞）、纳米微粒［如银纳米微粒（silver nanoparticle，AgNP）］。利用金属反应元件（metal response element，MRE）等反应元件驱动报告基因（如荧光蛋白）的表达，监测金属污染物，再利用终点和生物标志如生命体征、微量元素的组织分布、氧化反应或降解反应相关酶的表达等[24]，分析污染物的作用通路，并通过反应元件的创新、融合、最优重复次数尝试等，提高监测的效率和特异性。

在AgNP 对于水生生物的全身性毒性研究中，MARINHO 等[25]将成年斑马鱼分别暴露于1、3、5 μg/L的AgNP 处理96 h 后，获取器官，分析不同质量浓度AgNP 对斑马鱼脑、肌肉、鳃、肝组织的毒性。结果显示，不同质量浓度暴露均使得脑和肌肉组织中胆碱酯酶活性显著降低，肝和鳃组织中的过氧化氢酶活性显著降低，鳃中过氧化氢酶活性是AgNP 检测的最佳生物标志。ZHAO 等[26]在探究16 种稀土元素（rare earth element，REE）对斑马鱼胚胎发育影响的实验中，利用转录组学技术分析暴露于与受污染较严重地区的水环境镧和镨残余量相当质量浓度（1.1～10 mg/L）的斑马鱼，结果显示两者具有相似的作用机制，如5-羟色胺神经递质信号通路受干扰，心脏组织DNA 受损和凋亡活动增加，心肌肥大，心肌收缩功能受损，进而影响胚胎心血管形态以及出现运动行为、心脏生理异常等。

3.1.2 水环境有机污染物的毒理研究

有机污染物的常见类别有内分泌干扰物（endocrine disruptor，EDC）、芳香烃类污染物、手性有机物、阻燃剂（flame retardant，FR）、抗生素、农药、药品和个人护理用品（pharmaceutical and personal care product，PPCP）、商业合成物等。这些合成有机物的广泛使用和不当处理使其在水环境污染监测中被检测到的频率逐渐提高。如果有机污染物能够被生物吸收且不易在生物体内代谢分解，就会造成污染物在生物体内蓄积并沿着食物链富集。因此，提高水环境污染检测的敏感性，了解污染物对生物体的毒性作用机制，对于污染监测和损伤鉴定都具有重要意义[27]。利用各种类型的敏感反应元件，监测有机污染物，进行分离后可分析其作用通路。有机污染物的常见作用方式是干扰机体内源激素代谢，可导致出生缺陷、发育异常、行为异常、代谢紊乱、生存障碍、繁殖问题等[28]。

REN 等[29]将成年斑马鱼暴露于阻燃剂（磷酸三甲苯酯、磷酸甲苯二苯酯）和杀虫剂（氯氰菊酯、“灭多虫”）中处理15 d，暴露浓度均为5 μL/L 和25 μL/L，暴露期间定量监测斑马鱼的运动活力和生物节律，以研究斑马鱼对不同环境的适应性。结果显示，实验中的有机污染物处理均使斑马鱼运动行为受损，生物节律几乎无影响，浓度越高运动受损越严重，阻燃剂和杀虫剂的损伤效果相似。WU 等[30]对nmol/L 水平浓度雌酮和双酚A 进行长期［0～5 dpf（days post fertilization，受精后天数）］、短期［4～5 dpf］暴露的毒理学影响研究结果显示，长期暴露于雌酮会降低斑马鱼的运动行为活跃性，长、短期暴露于双酚A 导致的骨骼异常、运动行为改变和转录组反应均较雌酮更为显著，短期暴露于浓度大于100 nmol/L 的双酚A 中即可影响神经疾病相关的雌激素基因的表达。

3.2 法医毒理学

3.2.1 药物滥用或吸毒的毒理学研究

药物滥用或吸毒的毒理学研究目的是了解高浓度或低浓度多次给予药物或毒品在机体内的代谢和转化，以建立物质的体内代谢转化途径模型，研究结果除了可以应用于司法鉴定外，还有助于分析药物或毒品对机体的影响，寻找解决滥用和成瘾问题的有效物质或与滥用和成瘾物具有相似效果的替代物[31]。

针对常见滥用药物尼古丁对神经和生理长期影响的研究[31]发现，斑马鱼模型中的焦虑、记忆、社交行为及其相关分子机制均可作为评估尼古丁作用效果的指标。新型合成镇痛药物选择性阿片受体激动剂U-47700（3，4-dichloro-N-[2-（dimethylamino）cyclohexyl]-N-methylbenzamide）的滥用可导致兴奋、呼吸抑制等神经毒性，严重者可致死。利用斑马鱼进行U-47700 的精神药理学和毒理学研究[32]中，检测其对成年斑马鱼的急性（1、5、10、25、50 mg/L，处理20 min）和慢性（0.1、0.5、1 mg/L，处理14 d）影响。结果显示，U-47700 可透过血脑屏障，对斑马鱼中枢神经系统产生影响，其表现因剂量和处理手段不同而异，急性处理产生明显的镇静效应，慢性处理产生快速移动增加和焦虑样行为。

3.2.2 毒理学研究成果在司法鉴定中的应用前景

在司法鉴定中，可通过斑马鱼毒理学实验模型获取代谢机制数据，然后建立开放更新的代谢机制标准化数据库，再将司法鉴定中检测的人体数据与之关联，从而达到获取更为客观准确的法庭证据的目的。具体方法如下：

（1）建立标准化代谢通路数据库，如经济合作与发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）于2016 年建立的有害结局路径知识库（Adverse Outcome Pathway Knowledge Base，AOP-KB）[8，33]、BOUÉ 等于2015 年建立的因果关系生物网络（Causal Biological Network，CBN）数据库[8，34]。（2）从知识推动型思维出发，建立可以从物质结构推断其作用的模式框架[35]，如BURGOON 等于2020 年建立的贝叶斯网络（Bayesian networks）[8，36]、MARTIN等于2014 年建立的因果模型（causal modeling）[8，37]。（3）根据这些标准数据信息即可进行司法鉴定，具体思路为：①应用毒理学研究建立的实验模型，在环境损害司法鉴定中根据实际鉴定需求进行检测，得到数据的支持；②探索斑马鱼实验模型数据和人体检测数据融合的途径，将毒理学研究所得的数据应用于人体相关鉴定。

4 展 望

斑马鱼的毒理学研究不断推进，实验技术不断发展，其毒理学研究成果可以应用于生态领域进行环境保护，应用于医药领域促进人类健康发展。同时，可将斑马鱼毒理学研究引入法医学领域，应用于法庭科学中的环境损害鉴定、中毒鉴定、药物滥用鉴定。斑马鱼模型在法庭科学的应用研究，可以通过先建立斑马鱼模型，研究毒物的特定毒性机制，然后将斑马鱼实验结果与人体检测结果、法医病理学结果相结合，探索斑马鱼实验模型数据和人体检测数据融合的途径，实现斑马鱼模型在环境科学中的毒理学研究成果向法庭科学应用的转化，探索毒（药）物引起人身损害的识别、评估和追踪方法，创新司法鉴定方法和工作模式。