芹菜素对子宫内膜癌HEC-1-B细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

陈容，时艳华

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是常见的妇科恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性，EC的发病率与患者的生活习惯和区域密切相关，呈逐年增高趋势［1］。手术、放化疗等传统的治疗手段效果显著，但会产生肝肾损伤、胃肠道毒性、月经不调等不良反应［2］。目前，中医药治疗肿瘤日益受到临床的关注，中药在发挥多途径、多靶点治疗的同时，还具备不良反应少、机体耐受性好等优势［3］。芹菜素是一种天然的黄酮类化合物，目前已证实其具有抗炎、抗氧化和调节免疫等生物活性［4-5］。还能抑制多种恶性肿瘤的发生发展，包括乳腺癌［6］、黑色素瘤［7］、多发性骨髓瘤［8］、肝癌［9］等。然而，芹菜素对EC生物学功能的影响鲜见报道。本研究通过观察芹菜素对人子宫内膜癌HEC-1-B细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡等生物学功能的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 HEC-1-B细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。芹菜素购自武汉艾美捷科技有限公司，胎牛血清、RPMI 1640培养基、谷氨酰胺、青霉素-链霉素-两性霉素B购自美国Gibco公司，Annexin V-FITC∕PI凋亡试剂盒、CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司，促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2以及磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（AKT Serine∕Threonine Kinase，AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。细胞培养箱（MCO-18AC）购自日本三洋公司，流式细胞分析仪（CytoFLEX）购自美国贝克曼公司，凝胶成像仪（Gel Doc XR）购自美国伯乐公司，低温高速冷冻离心机（H2500R-2）购自湖南湘仪离心机有限公司。

1.2 细胞培养 HEC-1-B细胞常规培养于含10%胎牛血清、1 mmol∕L谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素-两性霉素B的RPMI 1640培养基中，置于5%CO2、37℃的细胞恒温培养箱中培养。待细胞生长至融合度达到80%～90%时进行传代处理，取生长状态良好的细胞用于后续实验。

1.3 CCK-8法测定细胞增殖能力 取处于对数生长期的HEC-1-B细胞，接种到96孔板中，每孔约5×103个细胞，待细胞贴壁生长稳定后进行给药处理。将芹菜素溶于DMSO，配制成50 mmol∕L的母液，实验组芹菜素浓度分别为0、20、40和80μmol∕L。将母液用培养基稀释成所需浓度，每个浓度设置12个复孔，分别在细胞培养24、48和72 h后每孔加入10μL CCK-8溶液，在培养箱中孵育1～4 h。然后，在450 nm的波长下测定各孔的光密度（OD）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验孔OD值∕对照孔OD值）×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期的HEC-1-B细胞，以1×106∕孔接种至6孔板。待细胞贴壁且生长稳定，向孔中分别加入20、40和80μmol∕L的芹菜素，并设置空白对照组。培养24 h后，弃去培养上清液，收集细胞。按照Annexin V-FITC∕PI凋亡试剂盒操作说明处理细胞，流式细胞仪检测不同浓度芹菜素处理后HEC-1-B细胞的凋亡情况。

1.5 Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力 取处于生长对数期的HEC-1-B细胞，用RPMI 1640培养基将细胞稀释至5×105个∕mL，取100μL细胞悬液加入Transwell小室的上室（其中侵袭实验预先在上室中加入100μL基质胶，迁移实验不需要加入基质胶），将Transwell小室置于24孔板中，并向下室中加入600μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基。培养1 h后，用RPMI 1640培养基分别将芹菜素母液稀释至0、5、10、20μmol∕L，随后替换下层培养基，继续培养24 h后取出Transwell小室。用4%的多聚甲醛在4℃固定15 min，0.1%结晶紫室温染色20 min。最后用脱脂棉球轻轻擦去Transwell上室中未发生侵袭和迁移的细胞，晾干后在显微镜下拍照，并计算细胞侵袭和迁移数量。

1.6 Western blot检测芹菜素对凋亡相关蛋白和PI3K∕AKT通路蛋白表达的影响 收集0、20、40、80μmol∕L芹菜素处理后的HEC-1-B细胞，加入细胞裂解液于冰上裂解30 min，之后4℃、12000 r∕min离心15 min，吸取上清液。BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，采用SDS-PAGE电泳分离蛋白，经转膜、5%脱脂牛奶封闭、一抗孵育、二抗孵育及显影等步骤后，用Image J软件对目的蛋白条带进行灰度值分析，计算相对表达量。实验中Bax、Bcl-2、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、GAPDH一抗稀释比例均为1∶1000，二抗稀释比例均为1∶8000。

1.7 统计学方法 所有数据采用GraphPad Prism 8.1进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示。2组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芹菜素对HEC-1-B细胞增殖能力的影响 20～80μmol∕L范围内，随着芹菜素浓度的升高和处理时间的延长，芹菜素对HEC-1-B细胞增殖的抑制作用越来越明显，见表1。

Tab.1 Comparison of inhibition rates of cell proliferation after apigenin treatment between three groups表1 芹菜素处理后各组细胞增殖抑制率比较（n=3，%，±s）

Tab.1 Comparison of inhibition rates of cell proliferation after apigenin treatment between three groups表1 芹菜素处理后各组细胞增殖抑制率比较（n=3，%，±s）

**P＜0.01；a与20μmol∕L组比较，b与40μmol∕L组比较，P＜0.05；组内比较：A与处理24 h比较，B与处理48 h比较

组别20μmol∕L组40μmol∕L组80μmol∕L组F 24 h 16.64±1.0548.71±1.46a 69.11±3.47ab 411.900**48 h 31.45±2.89A 61.87±3.32aA 79.90±0.67abA 271.50**72 h 46.25±5.13AB 70.17±6.44aAB 89.55±0.88abAB 61.720**F 55.030**19.300**70.820**

2.2 4组细胞凋亡水平比较 0、20、40和80μmol∕L的芹菜素处理HEC-1-B细胞后，细胞凋亡率（%）分别为6.21±0.94、13.51±1.69、21.87±1.06、30.24±2.34，随着芹菜素浓度的升高，细胞凋亡率逐渐增高（F=125.200，P＜0.05），组间多重比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.3 4组细胞凋亡相关蛋白表达水平的变化 0～80μmol∕L范围内，随着芹菜素浓度的升高，促凋亡蛋白Bax表达逐渐增高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐下降。见图2，表2。

Fig.2 Effects of apigenin on apoptosis related proteins图2 芹菜素对凋亡相关蛋白的影响

Fig.3 Transwell test showed that apigenin inhibited the invasion and migration of HEC-1-B cells(×100)图3 Transwell实验验证芹菜素抑制HEC-1-B细胞的侵袭和迁移（×100）

Tab.2 The expression levels of apoptosis related proteins of HEC-1-B cells in three groups表2 各组HEC-1-B细胞凋亡相关蛋白的表达水平（n=3，±s）

Tab.2 The expression levels of apoptosis related proteins of HEC-1-B cells in three groups表2 各组HEC-1-B细胞凋亡相关蛋白的表达水平（n=3，±s）

**P＜0.01，a与0μmol∕L组比较，b与20μmol∕L组比较，c与40μmol∕L组比较，P＜0.05

组别0μmol∕L组20μmol∕L组40μmol∕L组80μmol∕L组F Bcl-20.48±0.030.34±0.03a 0.22±0.04ab 0.12±0.03abc 65.530**Bax 0.15±0.040.28±0.03a 0.40±0.02ab 0.72±0.03abc 207.900**

2.4 芹菜素抑制HEC-1-B细胞的迁移和侵袭 经0、5、10和20μmol∕L的芹菜素处理后，细胞的迁移和侵袭数量逐渐较少，见图3，表3。

Tab.3 Effects of apigenin at different concentrations on migration and invasion of HEC-1-B cells表3 不同浓度芹菜素处理后HEC-1-B细胞迁移和侵袭能力比较（n=3，个∕视野，±s）

Tab.3 Effects of apigenin at different concentrations on migration and invasion of HEC-1-B cells表3 不同浓度芹菜素处理后HEC-1-B细胞迁移和侵袭能力比较（n=3，个∕视野，±s）

**P＜0.01，a与0μmol∕L组比较，b与5μmol∕L组比较，c与10μmol∕L组比较，P＜0.05

组别0μmol∕L组5μmol∕L组10μmol∕L组20μmol∕L组F细胞侵袭81.66±4.9053.15±2.28a 36.33±4.38ab 16.08±3.59abc 169.100**细胞迁移104.61±6.0785.46±8.73a 48.51±4.66ab 23.28±3.21abc 110.300**

2.5 芹菜素抑制HEC-1-B细胞内PI3K∕AKT信号通路的激活 40μmol∕L芹菜素处理HEC-1-B细胞24 h后，与0μmol∕L组相比，p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平均降低（均P＜0.01）。见图4，表4。

Fig.4 The expression of PI3K∕AKT pathway proteins detected by Western blot assay图4 Western blot检测芹菜素作用后PI3K∕AKT通路蛋白的表达变化

Tab.4 The expression levels of PI3K/Akt pathway proteins after treatment with 0μmol/L and 40μmol/L apigenin表4 0μmol/L和40μmol/L芹菜素作用后PI3K/AKT相关通路蛋白的表达水平变化 （n=3，±s）

Tab.4 The expression levels of PI3K/Akt pathway proteins after treatment with 0μmol/L and 40μmol/L apigenin表4 0μmol/L和40μmol/L芹菜素作用后PI3K/AKT相关通路蛋白的表达水平变化 （n=3，±s）

**P＜0.01

组别0μmol∕L组40μmol∕L组t p-AKT 0.33±0.050.15±0.015.342**AKT 0.48±0.040.46±0.040.612 p-PI3K 0.84±0.050.42±0.0312.510**PI3K 0.67±0.020.72±0.041.936

3 讨论

EC是仅次于宫颈癌的女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其发病呈年轻化趋势，严重威胁女性的健康［10］。目前临床上用于治疗EC的药物主要有阿霉素、环磷酰胺、顺铂或卡铂等，但以上药物毒性较大，并且患者久用易出现化疗耐药，使治疗失败的风险大大增加。因此，急需寻找和研发高效低毒、价格低廉的可替代药物。

芹菜素是广泛存在于果蔬中的天然化合物分子，在抑制肿瘤、炎症等方面作用显著［11］。本实验探索了芹菜素在抑制EC进展中的生物学功能，结果显示，芹菜素在体外能够抑制HEC-1-B细胞的增殖、迁移、侵袭且促进其凋亡，同时下调HEC-1-B细胞内p-AKT和p-PI3K蛋白的表达水平，这些结果表明芹菜素可能通过抑制PI3K∕AKT信号通路的激活进而抑制HEC-1-B细胞的增殖、迁移和侵袭，该研究结果与预期基本一致。本研究进一步丰富了芹菜素的抗肿瘤功能，同时也为后期芹菜素应用于临床治疗EC奠定了一定的理论基础。

在细胞受到死亡信号刺激时，促凋亡蛋白Bax在蛋白酶的作用下发生构象变化，引起细胞器功能丧失和促凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡，而抗凋亡蛋白Bcl-2则在Bax诱导凋亡过程中对其功能进行抑制［12］。研究表明，20μmol∕L的芹菜素能够抑制肝癌细胞Huh7和Hep3B的增殖，促进其凋亡［13］，并干扰肝癌细胞的信号传导［14］。10μmol∕L的芹菜素能够显著抑制血管内皮生长因子的表达和肿瘤诱导的血管生成［15］。本研究结果显示，在0～80μmol∕L范围内，随着芹菜素处理浓度的不断提高，促凋亡蛋白Bax的表达量逐渐增加，而抗凋亡蛋白的Bcl-2的表达量不断降低，说明芹菜素能够促进HEC-1-B细胞的凋亡。这一作用同样也体现在肺癌［16］和结肠癌［17］等肿瘤中，进一步证实了芹菜素的抗肿瘤功能。PI3K∕AKT信号通路作为细胞内重要的信号转导通路，参与多种生物学过程的调控。磷酸化的PI3K可以产生第二信使三磷酸肌醇，进一步使AKT的氨基酸残基发生磷酸化，从而发挥抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的作用。研究表明，芹菜素能通过PI3K∕AKT信号通路抑制宫颈癌细胞的迁移并促进其凋亡［18］。笔者推测在EC中芹菜素可能通过PI3K∕AKT信号通路发挥类似作用。进一步研究发现，芹菜素能够显著抑制p-PI3K和p-AKT的表达水平，提示在芹菜素的作用下，PI3K∕AKT信号通路在一定程度上被阻断，进而导致细胞增殖抑制，从而促进凋亡。

综上所述，芹菜素能够抑制HEC-1-B细胞的增殖、迁移、侵袭，同时诱导凋亡相关蛋白表达并促进其凋亡，其机制可能与芹菜素能够抑制PI3K∕AKT信号通路有关。