miR-199a在妊娠糖尿病中的表达及参与胰岛素抵抗的作用机制研究

马双玲，李国芸△，杨颖，李辞妹，周芳芳，张新宁，王茜

妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）指妊娠期发生或首次发现的糖耐量异常现象，是妊娠期最常见的内科综合征。目前，多数学者认为GDM的发生与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）关系密切［1］。微小RNA（miRNA，miR）可通过调控胰岛素合成、分泌、信号通路转导等过程，从而影响GDM进程［2］。研究显示，敲低miR-199a会导致肝脏葡萄糖耐量和清除率降低，miR-199a在IR中发挥重要作用［3］。沉 默 信 息 调 节 因 子1（silent mating type information regulator 2 homolog 1，SIRT1）∕叉头盒转录 因 子O1（forkhead box transcription factor O1，FOXO1）被认为是调控细胞增殖、细胞凋亡的信号通路，可直接调控胰岛素敏感性［4］。另有研究发现，miR-199a与SIRT1存在结合位点，miR-199a靶向SIRT1后能减轻脓毒症诱导的肺损伤［5］。目前，有关miR-199a在GDM中的作用及其与IR的关系鲜有报道，本研究就此进行探讨。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年10月—2020年10月于新乡市中心医院分娩的GDM孕妇（GDM组）56例为研究对象，年龄23～35岁，平均（28.16±2.61）岁；孕周37～40周，平均（38.35±1.16）周；收缩压92～128 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），平均（107.65±11.24）mmHg，舒张压56～89 mmHg，平均（74.32±8.37）mmHg。GDM诊断标准参照第8版《妇产科学》［6］。纳入标准：（1）符合GDM诊断标准。（2）资料完整。排除标准：（1）存在死胎儿或巨型胎儿史者。（2）心、肝、肾器官存在重大疾病者。（3）多囊卵巢综合征者。（4）服用激素等干扰糖代谢药物者。（5）有妊娠合并症及并发症家族史者。选择同期正常孕妇60例为正常孕妇组，年龄23～35岁，平均（28.35±2.46）岁；孕周37～41周，平均（38.43±1.23）周；收缩压93～123 mmHg，平均（108.36±10.69）mmHg，舒张压62～86 mmHg，平均（73.47±5.89）mmHg。2组年龄（t=0.404）、孕周（t=0.360）、舒张压（t=0.349）、收缩压（t=0.636）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经新乡市中心医院伦理协会审核并通过，患者或家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 人绒毛膜滋养层细胞HTR-8∕SVneo（武汉普诺赛生命科技有限公司）；胎牛血清（美国GIBCO公司）；棕榈酸、胰岛素（美国Sigma公司），miRNA inhibitor NC、miR-199ainhibitor、miRNA mimic NC、miR-199amimic、引物（广州锐博生物科技有限公司）；蒽酮（上海麦克林生化科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）检测试剂盒及SIRT1、FOXO1、乙酰化FOXO1（Ac-FOXO1）、GAPDH一抗及羊抗兔二抗（英国Abcam公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（碧云天生物科技有限公司）。全自动生化分析仪（型号：URIT-8021A；武汉科尔达医疗科技有限公司）；全自动凝胶成像系统（型号：Tocan240；上海领成生物科技有限公司）；实时荧光定量PCR（qPCR）仪（型号：VERITI；美国ABI公司）。

1.3 胎盘miR-199a及空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）检测

1.3.1 qPCR检测胎盘中miR-199a水平 取孕妇分娩时新生儿胎盘，Trizol法提取总RNA，反转录试剂盒反转录为cDNA，qPCR仪检测miR-199a水平。miR-199a引物：上游5'-ACACTCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3'；下 游5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6引物：上游5'-CTAGCTTCGGCAGCACA-3'；下 游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反应体系：2×Taq PCR混合液10μL、cDNA（50μg∕L）1μL、上下游引物各0.5μL、ddH2O 8μL。反应条件：95℃90 s；95℃30 s，59℃50 s，40个循环。2-ΔΔCt法计算miR-199a相对表达水平。

1.3.2 FBG、FINS检测 孕妇分娩前取肘正中静脉血5 mL，全自动生化分析仪检测FBG，放射免疫法检测FINS，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FBG（mmol∕L）×FINS（mU∕L）∕22.5。

1.4miR-199a对细胞功能的影响

1.4.1 细胞培养及IR模型制作 HTR-8∕SVneo细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养。棕榈酸0.027 g溶于0.1 mol∕L NaOH，70℃水浴配成1 mmol∕L母液待用；蒸馏水将胰岛素配制成10 mmol∕L母液，100倍稀释待用。参考文献［7］，依细胞处理方式不同分为对照组、棕榈酸组（250μmol∕L棕榈酸）、胰岛素组（0.25μmol∕L胰岛素）、模型组（250μmol∕L棕榈酸+0.25μmol∕L胰岛素），24 h后检测各组糖吸收情况。棕榈酸、胰岛素共同作用细胞24 h建立IR模型后将IR细胞再分为模型组、miRNA inhibitor NC组、miR-199ainhibitor组、miRNA mimic NC组、miR-199amimic组，除模型组外，其余各组以10μL Lipofectamine 2000分别转染4μg的miRNA inhibitor NC、miR-199ainhibitor、miRNA mimic NC及miR-199amimic，培养4～6 h，更换完全培养液后继续培养24 h。

1.4.2 qPCR检测细胞中miR-199a水平 按1.3.1中对应步骤检测细胞中miR-199a水平。

1.4.3 蒽酮法测定细胞内葡萄糖吸收量 参照文献［8］，葡萄糖水解成单体后与硫酸蒽酮反应生成蓝绿色产物，采用分光光度仪在620 nm波长处检测吸光度（A620）值变化，根据标准曲线计算葡萄糖含量；葡萄糖吸收量=培养基葡萄糖含量-所测葡萄糖含量。

1.4.4 上清液中SOD、MDA水平检测 细胞培养后收集培养液，500 r∕min离心5 min，收集上清液，上清液严格按照SOD活性检测试剂盒、MDA检测试剂盒步骤进行。酶标仪检测SOD、MDA水平。

1.4.5 Western blot检测细胞中SIRT1∕FOXO1通路SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白表达水平 蛋白裂解液冰上裂解细胞，4℃14000 r∕min离心20 min，上清液为总蛋白。凝胶电泳分离蛋白、NC膜转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；对应加入一抗SIRT1（1∶1000）、FOXO1（1∶2000）、Ac-FOXO1（1∶2000）、GAPDH（1∶5000），4℃孵育过夜；加入对应二抗（1∶5000），室温孵育1 h；DAB显色试剂盒避光显色，全自动凝胶成像分析系统拍照和定量分析。

1.5 双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-199a与SIRT1的靶向关系 在线软件Starbase（http:∕∕carolina.imis.athena-innovation.gr∕）分析SIRT1序列上是否存在miR-199a潜在结合位点，构建含miR-199a潜在结合位点的野生型载体（SIRT1 WT）和对应突变型载体（SIRT1 MUT）。将SIRT1 WT、SIRT1 MUT质粒载体分别与miR-199amimic、miRNA mimic NC共转染HTR-8∕SVneo细胞。双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶相对活性，验证miR-199a与SIRT1的靶向关系。

1.6 统计学方法 采用GraphPad 8.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以±s表示，2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q法。相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GDM组和正常孕妇组胎盘中miR-199a和HOMA-IR比较 GDM组较正常孕妇组胎盘中miR-199a相对表达水平以及HOMA-IR升高（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of miR-199a and HOMA-IR in the placenta between the two groups表1 2组胎盘中miR-199a和HOMA-IR比较（±s）

Tab.1 Comparison of miR-199a and HOMA-IR in the placenta between the two groups表1 2组胎盘中miR-199a和HOMA-IR比较（±s）

**P＜0.01

组别正常孕妇组GDM组t n 6056胎盘miR-199a 1.01±0.123.46±0.5931.485**HOMA-IR 5.96±0.9826.48±8.4818.617**

2.2 GDM患者miR-199a水平与HOMA-IR的相关性 GDM患者胎盘中miR-199a与HOMA-IR水平呈正相关（r=0.501，P＜0.05）。

2.3 IR模型验证 对照组、棕榈酸组、胰岛素组及模型组葡萄糖吸收量（mg）分别为2.19±0.17、3.69±0.17、3.72±0.13、1.85±0.07，差异有统计学意义（F=70.546，P＜0.05）。与对照组比较，棕榈酸组和胰岛素组葡萄糖吸收量升高，模型组葡萄糖吸收量降低（P＜0.05），模型组较棕榈酸组、胰岛素组葡萄糖吸收量降低（P＜0.05）。

2.4 各组miR-199a水平、葡萄糖吸收量及上清液中SOD、MDA水平比较 与模型组和miRNA inhibitor NC组比较，miR-199ainhibitor组细胞中葡萄糖吸收量及上清液中SOD水平升高，miR-199a水平、上清液中MDA水平降低（P＜0.05）。与模型组和miRNA mimic NC组比较，miR-199amimic组细胞中葡萄糖吸收量降低，miR-199a水平、上清液中MDA水平升高（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of miR-199a level,glucose uptake,SOD and MDA levels in supernatant between 5 groups of cells表2 5组细胞中miR-199a水平、葡萄糖吸收量及上清液SOD、MDA水平比较 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of miR-199a level,glucose uptake,SOD and MDA levels in supernatant between 5 groups of cells表2 5组细胞中miR-199a水平、葡萄糖吸收量及上清液SOD、MDA水平比较 （n=6，±s）

**P＜0.01；a与模型组比较，b与miRNA inhibitor NC组比较，c与miRNA mimic NC组比较，P＜0.05

组别模型组miRNA inhibitor NC组miR-199a inhibitor组miRNA mimic NC组miR-199a mimic组F miR-199a 0.96±0.091.01±0.120.36±0.03ab 1.03±0.131.86±0.22ac 16.095**葡萄糖吸收量（mg）2.41±0.162.39±0.083.95±0.11ab 2.42±0.111.13±0.08ac 79.832**SOD（U∕mL）248.49±15.91253.58±45.85386.85±38.94ab 247.95±18.45169.48±25.44c 6.327**MDA（μmol∕L）5.96±0.856.05±0.483.16±0.12ab 5.89±0.539.15±0.48ac 15.213**

2.5 各组SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白相对表达水平比较 各组FOXO1蛋白相对表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组和miRNA inhibitor NC组比较，miR-199ainhibitor组SIRT1相对表达水平升高。与模型组和miRNA mimic NC组比较，miR-199amimic组SIRT1相对表达水平降低、Ac-FOXO1相对表达水平升高（P＜0.05），见图1、表3。

Fig.1 Changes of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein detected by Western blot assay图1 Western blot法检测SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白变化

Tab.3 Protein levels of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 in the 5 groups of cells表3 5组细胞中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平（n=6，±s）

Tab.3 Protein levels of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 in the 5 groups of cells表3 5组细胞中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平（n=6，±s）

**P＜0.01；a与模型组比较，b与miRNA inhibitor NC组比较，c与miRNA mimic NC组比较，P＜0.05

组别模型组miRNA inhibitor NC组miR-199a inhibitor组miRNA mimic NC组miR-199a mimic组F SIRT11.56±0.121.62±0.082.54±0.14ab 1.53±0.110.84±0.12ac 27.401**FOXO10.46±0.090.41±0.040.47±0.050.50±0.060.49±0.050.527 Ac-FOXO15.96±0.856.05±0.483.86±0.125.89±0.539.15±0.48ac 12.134**

2.6miR-199a与SIRT1的靶向关系验证 Tarbase数据库分析显示，miR-199a与SIRT1存在互补的结合位点，见图2。miR-199amimic+SIRT1 WT组、miRNA mimic NC+SIRT1 WT组、miR-199amimic+SIRT1 MUT组、miRNA mimic NC+SIRT1 MUT组荧光素酶相对活性分别为（0.47±0.06）、（1.01±0.09）、（0.99±0.08）、（1.00±0.09）。与miRNA mimic NC+SIRT1 WT组比较，miR-199amimic+SIRT1 WT组荧光 素 酶 相 对 活 性 降 低（t=12.229，P＜0.05）；与miRNA mimic NC+SIRT1 MUT组比较，miR-199amimic+SIRT1 MUT组荧光素酶相对活性差异无统计学意义（t=0.203，P＞0.05）。

Fig.2 Verification of the targeting relationship between miR-199a and SIRT1图2 miR-199a与SIRT1靶向关系的验证

3 讨论

GDM患者发生IR会影响外周组织对葡萄糖的摄取，当IR发生时导致胰岛素促进葡萄糖摄取和利用效率降低，机体代偿性分泌过多胰岛素以维持血糖稳定，改善IR能部分提高葡萄糖在体内摄取率，从而缓解疾病［9-10］。因此，改善IR对GDM意义重大。

miRNA在维持葡萄糖稳态和糖尿病发生中发挥重要作用。miR-199a在人体中广泛存在，可通过调控多种信号通路并影响氧化应激等［11］。miR-199a参与脂肪分化、IR、炎症反应及细胞周期调控和能量代谢过程［12］。在IR的小鼠血清微阵列芯片检测中发现，与正常小鼠相比，miR-199a在IR小鼠血清中呈高表达，推测miR-199a参与糖尿病和IR的发生过程［13-14］。本研究发现，与正常孕妇相比，GDM患者胎盘中miR-199a水平、HOMA-IR升高，提示GDM患者存在miR-199a表达异常和IR。相关性分析显示，GDM患者miR-199a与HOMA-IR呈正相关，提示miR-199a与IR的发生存在一定关系。单独用棕榈酸、胰岛素处理后，细胞中葡萄糖吸收量均升高，提示无论是单独添加棕榈酸还是胰岛素均可促进葡萄糖吸收；但棕榈酸与胰岛素联合处理后葡萄糖的吸收量降低，表明两者协同作用时发生了IR。与模型组相比，miR-199ainhibitor组细胞中miR-199a降低、miR-199amimic组细胞中miR-199a升高，提示miR-199ainhibitor和mimic转染成功。而降低miR-199a后细胞对葡萄糖的吸收量增加，提示降低miR-199a后细胞对胰岛素敏感性增加，导致葡萄糖吸收增强，增加miR-199a后细胞对葡萄糖的吸收降低，IR作用增强。

SIRT1是一类进化上高度保守的蛋白，参与细胞内多种生物学过程，参与各种代谢和病理生理过程［15］。SIRT1调节葡萄糖和胰岛素分泌过程，当血糖水平升高时，Sirt1可促进胰岛β细胞分泌胰岛素，从而血糖维持在正常水平［16］。SIRT1亦可通过调控FOXO1乙酰化水平发挥作用［17］。FOXO1是胰岛素信号通路的关键下游分子，可调节糖代谢、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等，从而参与IR过程［18］。降低SIRT1可使FOXO1乙酰化后的活性增强，引起细胞损伤严重、凋亡增加，进而增强IR［19-20］。SOD反映机体清除氧自由基水平，MDA可反映机体过氧化程度和细胞损伤程度。本研究发现，与模型组比较，miR-199ainhibitor组SIRT1相对表达水平升高，miR-199amimic组SIRT1相对表达水平降低、Ac-FOXO1相对表达水平升高。以上结果表明，miR-199a表达降低后促进SIRT1表达，抑制FOXO1乙酰化，降低上清液中MDA水平，促使细胞清除机体内氧自由基，促进葡萄糖吸收，从而提高细胞对胰岛素的敏感性，降低IR，而miR-199a表达升高后则表现出相反的作用。

综上所述，miR-199a在GDM患者胎盘中高表达，且与IR关系密切，升高miR-199a可通过靶向下调SIRT1而促进FOXO1乙酰化，促进IR，但miR-199a靶基因众多，是否还存在别的通路发挥作用，有待进一步研究。