凝结芽孢杆菌蛋白质提取方法

陈向东 王宗继 徐丽 杜广青 胡靖敏 王永红

1.目的

蛋白质是代谢反应中的功能执行者，直接催化反应的发生，而不同代谢状态下蛋白的表达及活性都有不同程度的差异，通过不同状态下蛋白表达的差异来反映代谢途径的改变。细胞破碎和蛋白质提取是获得蛋白质提取量的关键，目前凝结芽孢杆菌细胞破碎和蛋白提取的研究比较少，因此将建立凝结芽孢杆菌细胞破碎和蛋白质提取的方法。

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验试剂

蛋白提取缓冲液见表2.1，SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶配方见表2.2和表2.3，脱色液见表2.4，SDS上样缓冲液见表2.5，考马斯亮蓝染色液见表2.6。蛋白定量采用BCA法蛋白质浓度测定试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

2.1.2实验仪器与设备

2.2实验方法

2.2.1细胞破碎方法

冻干后液氮研磨：保存于-80 ℃冰箱中的菌体样品先于冻干机中冻干至少24 h，之后，将冻干后的菌体置于预冷过的研钵中同时加入液氮一起研磨，液氮研磨时间为10 min，研磨成粉末状之后加入到裂解液中，6000 rpm 离心30 min 后取上清。

冻融法：保存于-80 ℃冰箱中的样品重悬于裂解液中，将样品于-80 ℃冰箱冷冻10min 中，之后于95 ℃煮10 min，重复以上步骤3-5 次，6000 rpm 离心30 min 后取上清。

超声裂解法：保存于-80 ℃冰箱中的菌体样品重悬于裂解液中，超声破碎仪使用3 mm微探头，功率设置为650 W×55%，超声5 秒，停5 秒，如此反复多次，整个过程要确保在冰上进行且持续20 min 左右，6000 rpm，30 min 后保留上清。

冷冻破碎法：保存于-80 ℃冰箱中的菌体样品重悬于裂解液中，加入0.5g磁力玻璃珠，于全自动样品冷冻研磨仪，65Hz，10min。将破碎完的菌体离心，6000 rpm 离心30min 后取上清。

2.2.2蛋白浓度测定

计算BCA工作液总体积：BCA工作液总体积=（标准曲线测定点数+样品数）×重复次数×每个样品所需的BCA工作也体积;根据所需BCA工作液总体积，定量取溶液A：溶液B=50：1，混匀制成BCA工作液;按照表2.8制备BCA标准曲线。

采用酶标板法，向酶标孔中分别加入5μL不同浓度的标准蛋白溶液;每个标准品设置2个重复，各孔分别加入5μL溶液F，37℃水浴中保温30min，随后个加入200μL BCA工作液，迅速混匀，在37℃水浴中保温30min.冷却至室温后，在酶标仪上测各孔的A562值。以各孔A562平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3.结果

3.1蛋白浓度标准曲线

以BSA（牛血清蛋白）浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制BCA标准曲线见图3.1，相关系数R2为0.9941。

3.2蛋白提取方法筛选

3.2.1细胞破碎方法筛选

细胞破碎方法分别选用了冻融法、冷冻破碎法、超声破碎法和冻干后液氮研磨法。根据图3.2，镜检结果显示经过冻融法破碎后凝结芽孢杆菌形态变化不大;使用玻璃珠冷凍破碎和冻干后液氮研磨可打碎部分杆菌，杆菌形态长短不一，破碎不均匀;使用3 mm微探头，功率650 W×55%，超声20min后菌体形态呈现均匀的短杆状。

为了进一步探究细胞破碎的效果，比较了四种破碎方法提取的蛋白浓度差异并结合SDS-PAGE结果进行分析。从提取的蛋白浓度来看，冻干后液氮研磨>冷冻破碎>超声破碎>冻融法（表3.1），结合相应的电泳图（图3.3），冻干后液氮研磨提取的蛋白种类最多。尽管，超声破碎后得到均匀的短杆状，由于超声过程中不可避免有产热以及大量泡沫，最终都会影响蛋白提取效果。综上所述，最终选择冻干后液氮研磨法进行细胞破碎进行后续实验。

3.2.2蛋白提取缓冲液成分及用量优化

3.2.1.1不同蛋白提取缓冲液筛选

在细胞破碎方法为冻干后液氮研磨的条件下，比较了不同缓冲液的提取效果，采用Tris-HCl pH6.7，2%SDS，蛋白裂解液（0.1M Tris-HCl pH 7.6、2%SDS、0.1M DTT、1mM PMSF）进行蛋白提取。结果表明，蛋白裂解液提取的蛋白量大（表3.2），SDS-PAGE电泳图的条带数也比另外两种缓冲液多（图3.4）。

3.2.1.2蛋白裂解液用量筛选

蛋白裂解液分别调整SDS为2%、4%，DTT为0.1M、0.2M，20mg（菌粉）分别加入裂解液用量1mL、2mL、4mL进行对比（表3.3）。根据蛋白浓度测定结果，比较裂解液1和3，2和4发现，SDS调整为2%时，蛋白提取浓度以及种类更多;而DTT用量的改变并没有影响蛋白提取的效果;裂解液的用量增加到2mL时，蛋白提取效果更好，进一步将裂解液用量增加至4mL后，蛋白的提取效果没有进一步提高（表3.4、图3.5）。最终确定蛋白裂解液的配方为0.1M Tris-HCl pH 7.6、2%SDS、0.1M DTT、1mM PMSF，用量为2mL。

作者简介：陈向东（一作），汉族，男，山东省临沂市，1980.06.05，本科，工程师，山东卫康生物医药科技有限公司，食品工程。