绿原酸抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞系HK-2纤维化因子表达

孙梦奎，李守林

(深圳市儿童医院 泌尿外科，广东 深圳 518038)

肾脏纤维化(renal fibrosis)包括肾小球硬化、肾小管萎缩、肾间质纤维化及细胞外基质异常分布等，是各类肾脏疾病、损伤进展到终末期时的主要病理改变之一。探索如何延缓甚至逆转肾脏纤维化从而更好的保护肾脏功能一直是研究的热点。绿原酸(chlorgenic acid，CGA)是由咖啡酸和奎宁酸聚合所形成的酯酸，是植物经有氧呼吸过程产生的苯丙素类化合物。有报道称其能够有效的缓解肺[1]、肝脏[2]等器官的纤维化。但是，其对肾脏纤维化是否有影响却暂无相关报道。肾脏纤维化的一个显著特点就是肾小管上皮细胞表达胶原纤维蛋白Ⅰ和Ⅲ增加。本研究拟探索CGA对人肾小管上皮HK-2细胞表达纤维化因子的影响及其潜在分子机制，为临床上治疗肾脏纤维化提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

人肾小管上皮细胞系HK-2(ATCC公司)；细胞培养基DMEM/F-12(Hyclone公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；绿原酸(Sigma-Aldrich公司)；重组人TGF-β1(PeproTech公司)；TRIzol试剂(Invitrogen公司)；RNA反转录试剂盒(TaKaRa公司)；目的基因上下游引物(上海生工生物工程有限公司)；TLR4(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB)、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB及GAPDH抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组:于含10%胎牛血清、青霉素 100 IU/mL和链霉素 100 IU/mL的DMEM/F-12培养基中培养人肾小管上皮HK-2细胞，培养条件为37 ℃，5% CO2细胞孵育箱中。CGA对HK-2细胞增殖的影响中，细胞分组为0、20、40、80 μg/mL的CGA分别处理细胞0、12、24、36、72 h，共20组。后续实验分组：对照组(磷酸盐缓冲液处理48 h)，TGF-β1组(5 ng/mL人重组TGF-β1处理48 h)。CGA组(20、40、80 μg/mL的CGA处理48 h)。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖:将处于对数增殖期的HK-2细胞混悬液以2×104个/mL接种于96孔板，每孔100 μL。静置24 h待细胞贴壁后，用……