基于TP-M13-SSR标记的石斛兰种质分子身份证构建

肖文芳，李佐，陈和明，吕复兵

摘  要：利用TP-M13-SSR分子标记，以收集保存的29份石斛兰种质为试材，对其遗传多样性进行分析并构建分子身份证。14对SSR引物在29份种质间共检测出191个等位基因，引物检出率为79.31%～100%;引物多态性信息含量为0.3877～0.9484，平均0.7956;Shannon指数为0.8702～3.1553，平均2.1606。29份种质间的遗传相似性系数为0.3037～ 0.9005，在0.7000处可将全部种质分为6个类群。根据引物通用性和Shannon指数高低，从1对引物开始逐步增加引物数量筛选可将29份种质全部区分的引物组合，最终确定核心引物组合为DoeSSR5+DoeSSR87+DoeSSR97。基于这3对核心引物的扩增结果，将等位基因编码成字符串获得29份石斛兰种质独有、可辨的分子身份证。

关键词：石斛;TP-M13-SSR;分子身份证

中图分类号：S682.31      文献标识码：A

Molecular Identity Card Establishment of Dendrobium Germplasms by TP-M13-SSR

XIAO Wenfang1，2， LI Zuo1，2*， CHEN Heming1，2， LYU Fubing1，2

1. Environmental Horticulture Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China; 2. Guangdong Key Lab of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract： A total of 29 Dendrobium germplasms were studied with tailed primer M13 microsatellite markers （TP-M13- SSR）. Analysis was made to perform the genetic diversity and establish the germplasms molecular ID. The results showed that by using 14 selected SSR markers， 191 alleles were detected and the detection rate was 79.31%-100% per primer. The polymorphism information content was 0.3877-0.9484， 0.7956 on average. Shannons information index was 0.8702-3.1553 and the average value was 2.1606. The genetic similarity coefficient of the germplasms ranged from 0.3037 to 0.9005， and all germplasms could be divided into 6 groups at 0.7000. Based on transferability and Shannons information index of the primers， more and more loci were added to distinguish all the germplasms. Finally， DoeSSR5， DoeSSR87 and DoeSSR97 at least were screened. Loci that amplified by the markers were coded to establish the unique and identifiable molecular ID of the germplasms.

Keywords： Dendrobium; TP-M13-SSR; molecular identity card

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.002

石斛属（Dendrodium， Den.）为兰科三大属之一，全属原生种约2000个，广泛分布于亚洲热带、亚热带地区至大洋洲，我国原产约80余种[1]。石斛兰分布范围宽广、生长环境多样，导致种质资源丰富多变，既有花繁色艳、极具观赏价值的种质，又有极具药用价值的传统名贵中药材——霍山石斛、铁皮石斛等。我国在石斛药用价值方面的研究较早较多，但对各类不同種质资源的精准鉴定、深入挖掘和利用方面的研究较少。收集、整理、保存、鉴定石斛兰丰富的种质资源，是合理开发利用、保证药用石斛安全性和观赏石斛新品种选育的基础。

TP-M13-SSR（tailed primer M13 microsatellite markers）技术结合了SSR分子标记技术和荧光测序技术，具有重复性高、结果准确等优点，在较大程度上解决了传统凝胶电泳SSR分子标记分析通量较低、扩增产物检测流程繁琐、数据记录工作量大等一系列问题[2]，已在芍药品种资源分子身份证构建[3]、茶花新品种鉴别[4]、百合种质资源分子身份证构建[5]、牡丹品种的分子身份证构建[6]等各类观赏花卉中取得成功应用，在兰科植物中已成功应用于蝴蝶兰的突变体鉴定[7]和建兰的核心种质构建[8]。目前，TP-M13-SSR在石斛属中仅应用于铁皮石斛实生群体遗传多样性的分析上[9]，而石斛兰种质资源鉴定、遗传多样性分析及指纹图谱构建等主要仍是采用基于传统凝胶电泳的SSR分子标记技术[10-12]或者其他类型分子标记技术[13-15]。

为充分保护和利用石斛兰种质资源，本研究通过TP-M13-SSR技术筛选高效通用的引物对石斛属内28个原生种和1个流行商品品种进行分析检测，从DNA水平揭示石斛兰种质资源的遗传多样性并构建分子身份证，为石斛兰种质资源的保护及开发利用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

29份石斛兰种质具体信息见表1，种植于广东省农业现代化科技示范区广东省农业科学院环境园艺研究所温室大棚内。2020年5月采集实验材料的根尖或嫩叶，置于液氮中速冻15 min后于–80 ℃超低温冰箱储存备用。

1.2  方法

1.2.1  总DNA提取  每份种质取0.2 g样品，利用新型植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取样品DNA，并溶解于80 ?L 1×TE溶液中。NanoDrop分光光度计和1.2%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，检测合格后存储于–20 ℃冰箱中备用。

1.2.2  引物筛选  根据前人研究结果，挑选了50对在石斛兰中扩增效果较好的引物进行扩增[11， 16-19]，分别采用FAM和HEX 2种不同颜色的荧光标记，挑选能稳定扩增出条带的引物作为筛选出的引物。

1.2.3  PCR反应  所有引物在不同样品中进行10 ?L反应体系的单重PCR扩增，其中含1.2 ?L DNA模板（50 ng/?L），各0.3 ?L上下游引物（5 ?mol/L），1.0 ?L 10×Buffer Ι缓冲液，0.1 ?L TAKARA HS Taq酶（5 U/?L），0.8 ?L dNTP（2.5 mmol/L），0.5 ?L TP-M13（5 ?mol/L），5.8 ?L

去离子水。扩增程序如下：95 ℃，5 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环;95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环;60 ℃，30 min。

1.2.4  检测及分析  96孔板中每孔加入1.0 μL扩增产物，9 μL体积比为0.5∶8.5的ROX-500分子量内标和甲酰胺混合液，95 ℃变性3 min后上ABI 3730XL检测仪进行检测，1 kV电压进样10 s后15 kV电压电泳30 min。Data Colletion软件收集原始数据并导入GeneMapper 3.2中，根据泳道中分子量内标计算出各峰值的大小。3次重复毛细管电泳检测，取平均值四舍五入作为实验材料在该位点上的片段大小。

1.3  数据处理

将整理好的数据，运用PopGene、NTSYS软件进行遗传多样性指标、聚类作图及多态信息含量计算分析。

2  结果与分析

2.1  引物筛选及通用性、多态性分析

从50对引物中筛选出14对能稳定扩增出条带、无杂峰，且通用性较高的引物用于29份石斛兰种质的鉴定。14对引物共扩增出191个峰，扩增片段大小为97～292 bp。引物通用性方面，DoeSSR5和DoeSSR87最佳（DoeSSR5在部分样品中的扩增峰见图1），在29份种质中均能扩增出条带，而其他引物存在在部分种质中不能扩增出条带的现象（表2）。其中DoeSSR4在美花石斛中未能扩增出条带，DoeSSR15在纯白紫瓣石斛中未能扩增出条带，DoeSSR23在茉香石斛、尖刀唇石斛和木石斛中未能扩增出条带，DoeSSR26在茉香石斛、勐腊石斛和木石斛中未能扩增出条带，DoeSSR28在茉香石斛、玫瑰石斛、黄贝壳石斛、聚石斛和铅笔石斛中未能扩增出条带，DoeSSR41在尖刀唇石斛和河口石斛中未能擴增出条带，DoeSSR51在棒叶石斛中未能扩增出条带，DoeSSR67在茉香石斛中未能扩增出条带，DoeSSR84在茉香石斛、雪山石斛、矩唇石斛、木石斛、棒叶石斛和美花石斛中未能扩增出条带，DoeSSR93在茉香石斛、雪山石斛、喇叭唇石斛、木石斛、美花石斛和绒毛石斛样品中未能扩增出条带，DoeSSR97在河口石斛中未能扩增出条带，DoeSSR107在报春石斛、黄喉石斛、铁皮石斛、河口石斛、聚石斛和铅笔石斛中未能扩增出条带。但通用性最低的引物其检出率

也超过79%，说明本研究筛选的引物在石斛属种间的通用性较高。

14对引物在29份石斛种质中共检测到191个等位基因，不同引物检测到的等位基因数目（Na）从5个（DoeSSR5）到27个（DoeSSR26）不等，平均13.6429个;观测杂合度（Ho）变化范围从0.0807（DoeSSR107）到0.6897（DoeSSR41），平均0.3754;期望杂合度（He）变化范围从0.4064（DoeSSR107）到0.9506（DoeSSR26），平均 0.8116;多态性信息含量（PIC）最低值为0.3877（DoeSSR107），最高为0.9484（DoeSSR26），平均0.7956，除引物DoeSSR107外，其他引物均呈高度多态性

（PIC>0.5）;Shannons多样性指数（I）的变化范围从0.8702（DoeSSR107）到3.1553（DoeSSR26），平均为2.1606（表3）。引物多态性分析表明本研究筛选的14对引物在29份种质中的多态性较高。

根据引物通用性和Shannons指数，从1对引物开始逐步增加引物数量筛选可将供试材料全部区分的引物组合，最终确定核心引物组合DoeSSR5+DoeSSR87+DoeSSR97能够将所有样品区分开，可作为今后石斛兰种质资源鉴定的核心引物，其他引物作为备选。

2.2  29份石斛兰种质聚类分析

利用14条SSR引物扩增结果计算出29份石斛兰种质遗传相似性系数变化范围为0.3037～ 0.9005。其中，线叶石斛和晶帽石斛的遗传相似性系数最大，说明在这29份种质中线叶石斛和晶帽石斛的遗传差异相对较小;茉香石斛和河口石斛的遗传相似性系数最小，说明在这29份种质中茉香石斛和河口石斛的遗传差异相对较大。在遗传相似性系数为0.7000时，可将29份石斛兰种质划分为6个类群（图2）。第一类群包括茉香石斛和木石斛，二者均为原产热带地区的黄色系具花香的石斛兰原生种;第三类群为纯白紫瓣石斛，为紫瓣石斛的白变种;第四类群为勐腊石斛，原产我国云南省，在泰国和缅甸也有分布的纯黄色石斛属原生种;第五类群为美花石斛，广泛分布于东南亚地区，在我国中南部、东南部和海南也都有分布的紫红色浓香型石斛兰原生种;第六类群为河口石斛，只分布于我国云南省和越南的一种迷你型石斛兰原生种;其余23份种质均在第二

类群。第二类群又可分为4个小群，其中尖刀唇石斛单独一个小群，尖刀唇石斛为石斛属中分布最广的原生种之一;聚石斛和铅笔石斛聚在一个小群，聚石斛广泛分布于我国西南部地区和东南亚各国，本研究采用的是泰国产原种，而铅笔石斛则是只产于澳大利亚的一种连茎棒叶石斛属原生种;雪山石斛、距唇石斛和棒叶石斛聚在一个小群，雪山石斛为长苞石斛（Den. bracteosum）和亮叶石斛（Den. laevifolium）杂交选育出的优良品种，距唇石斛目前只在我国广西和台湾岛台北以南的乌来区有分布，棒叶石斛则是只产于澳大利亚的另一种连茎棒叶石斛属原生种;剩余的17份不同的石斛属原生种则聚在一个小群。

2.3  29份石斛兰种质分子身份证构建

对3对核心SSR引物扩增结果进行数据化编码构建29份石斛兰种质分子身份证，各引物扩增片段按分子量大小排列，从小到大以阿拉伯数字1～9标注，9个以上的片段以大写英文字母A、B、C等标注，若该位点在某个种质中无扩增则记为0。每个引物占2位，标记的顺序依次为DoeSSR5、

DoeSSR87、DoeSSR97。构建的29份石斛兰种质分子身份证代码均不相同，能够将所有种质区分开（表4）。其他引物作为备选引物便于今后扩大鉴评范围，可实現石斛兰种质资源的数字化管理。

3  讨论

本研究从50对SSR引物中筛选出14对能稳定扩增出条带、无杂峰的引物用于29份石斛兰种质的鉴定，引物通用性均超过79%，除引物DoeSSR107外的其他引物均呈高度多态性，说明本研究筛选的引物在石斛属内不同种间应用性较好，可以一定程度反应石斛属内种质资源丰富的遗传多样性。扩增结果表明，29份种质遗传相似性系数变化范围较大，遗传多样性较高，这与本研究采用的石斛兰种质资源丰富多变、形态多样的表型特征一致。本研究采用的29份石斛兰种质包括28个原生种和1个流行商品品种（2个不同原生种的杂交后代），地理分布跨度较广，从澳洲（铅笔石斛等）到缅甸、越南（绒毛石斛等）再到我国（霍山石斛等）;形态差异较大，从株型可达1.5 m的齿瓣石斛到最高只有4 cm左右的河口石斛，从花朵直径可达10 cm的喇叭唇石斛到花朵直径仅1 cm左右的河口石斛，包括具浓香的茉香石斛等和无香的雪山石斛等，具金黄色花的密花石斛、纯白色花的木石斛、紫红色花的美花石斛和浅黄绿花的铁皮石斛等。前人利用ISSR标记分析29种石斛兰[20]、SRAP分子标记分析48份石斛兰种质资源[14]、SSR分子标记分析32份石斛兰种质资源[11]同样发现石斛兰种质资源遗传多样性较高。如此丰富多变的种质资源仅利用10多对SSR引物并不能完全呈现出其遗传多态性，这可能是导致本研究根据遗传相似性聚类的结果并没有明显的分类规律的原因，在前人的研究中，应用不同的分子标记方法对石斛兰不同的种质资源进行分类的结果与传统形态学分类方法相比都有一致和不同的地方[10-11， 13-14， 20]。所以针对石斛兰种质资源亲缘关系的分析应该结合分析标记、形态学分类及杂交亲和性等多方因素，单一方法目前不能完全呈现其遗传多样性。

种质资源分类及鉴评是开发利用工作的基础。石斛属作为兰科三大属之一，具极高的开发应用价值，但长期以来我国针对石斛属种质资源的研究主要集中在药用石斛上[21-24]。近年来基于国家对种质资源的重视，开始有针对其他种质资源分子鉴评的相关研究[10-11， 13-14， 20-21]，但相对于石斛属庞大的种质资源来说，相关研究还远远不够，且目前尚无石斛属种质资源分子身份证构建方面的研究。分子身份证是运用不同的编码方式对分子标记扩增结果进行编码后得到的字符串，能够更加简单明了地区分种质资源，克服传统分类比对的繁琐、低效等问题[6]，既能避免重复性的收集和保存，剔除同名异物和同物异名的种质资源，又有利于科学高效地进行种质资源的鉴定评价和利用。本研究筛选出的14对引物能够为29份不同石斛兰种质构建独一无二的分子身份证，其中的3对核心引物就能够将29份种质完全区分开，其余引物的通用性和多态性也非常高，均可作为后续对其他更多石斛属种质资源进行鉴评和分子身份证构建的备选引物，为石斛属种质资源的分类、鉴定和利用提供一定的科学依据。

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责任编辑：谢龙莲