火龙珠种子无菌萌发研究

李晓亮 杨世先 杨进成 王刚 张钟 陈佳清 周翠英 左丽娟 邓成忠 张玉荣 段永华

摘要 [目的]建立火龙珠种子的无菌苗技术体系，为火龙珠的种苗快繁、种质保存、遗传转化及杂交实生苗获得等提供可行的技术途径。[方法]选择和采集4种不同大小的火龙珠果实进行灭菌、无菌播种和种子培养试验，调查记录种子的萌发情况。[结果]火龙珠果实的适宜灭菌方法是0.20% HgCl2灭菌8～16 min;火龙珠不同种子的无菌萌发差异明显，相比其他3类果实的种子，最大横径为（11.19±0.21） mm、单果重（0.66±0.02） g的果实内种子发芽起始时间较早（30 d后），发芽持续时间较长（60 d），萌发频率较高（100%），发芽率较大（7.81±0.50）%，种子萌发形成的幼苗株高、叶片数、节间距、节段数、增殖系数等较大，幼苗生长势较强，是火龙珠无菌苗获得的适宜果实。[结论]通过选择合适的火龙珠果实进行种子无菌播种，可以建立火龙珠高效的无菌苗技术体系，且是一个重要的途径。

关键词 火龙珠;果实;种子;组织培养;无菌萌发

中图分类号 S 686  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）23-0140-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.038

Study on Seed Aseptic Germination of Hypericum

LI Xiao-liang， YANG Shi-xian， YANG Jin-cheng et al

（Yuxi Academy of Agricultural Sciences， Yuxi， Yunnan 653100）

Abstract [Objective]To establish the aseptic seedling technical system of Hypericum by its seeds， in turn to provide one feasible technical approach for rapid propagation of seedling， germplasm conservation， genetic transformation， and hybrid seedling， etc.[Method] 4 different types fruits of Hypericum were selected and gathered to carry out experiments of sterilization， aseptic seed sowing and seed culture.[Result] The results showed that a suitable approach for fruits of Hypericum was to treat 8-16 min by 0.20% HgCl2， and there was a great difference in different seeds aseptic germination of Hypericum. Compared with seeds in the other 3 kinds of fruits， fruits containing maximum diameter of （11.19±0.21）mm and single fruit weight of （0.66±0.02） g were suitable fruits for obtaining aseptic seedling of Hypericum， because its seed had earlier （30 d after aseptic seed sowing） and last for 60 d of seed germination， higher germination frequency of 100%， higher germination rate of （7.81±0.50）%， higher indexes of seedlings height， leaf number， knot spacing， sections and proliferation coefficients， and stronger seedling growth vigour.[Conclusion] It is the seed aseptic germination of these suitable Hypericum fruits that establish  an efficient aseptic seedling technical system of Hypericum， which is an important approach.

Key words Hypericum;Fruit;Seed;Tissue culture;Aseptic germination

基金項目 玉溪市农业科学院科研项目“作物组培扩繁及配套栽培技术研究与应用”（YXNKYZP2020）。

作者简介 李晓亮（1982—），男，云南江川人，高级农艺师，硕士，从事植物（作物）组织培养技术研究与应用、果蔬作物的育种及栽培等。通信作者，高级农艺师，从事果蔬作物育种及栽培研究。

收稿日期 2021-07-19

种子是种子植物特有的器官，繁殖是其主要功能，这对于延续物种起着至关重要的作用。利用植物组织培养技术（简称“组培”）进行种子的培养，可以快速繁殖种苗，打破种子休眠以促进其萌发，解决作物杂交胚胎败育及繁育作物杂交的后代等具有重要意义[1]。国内以种子开展植物组织培养研究的报道较多，如石斛[2]、白芨[3]、云南甜龙竹[4]、牛角瓜[5]、黄精[6]、灰岩金线莲[7]等作物的组培快繁种苗技术研究;月季的休眠种子无菌萌发研究[8];月季的胚挽救技术研究[9];金花茶杂交种子的组培研究[10]等。火龙珠（Hypericum），属金丝桃科欧金丝桃属，低矮灌木，单叶，对生或轮生，有腺点，多全缘，花瓣为5瓣，以黄色为主，雄蕊多数，通常合生，火龙珠常用作切果或观花，叶厚纸质，果形高圆、无青肩、成熟后大红亮丽，富光泽，经久贮存果色不变，娇艳可爱，深受人们的喜爱，是一种重要的观赏性花卉植物[11]。近年来，火龙珠的生产发展迅速，因其种植投资成本低（不需大棚设施等）、产量高、价格好、见效快等优点，形成火龙珠较好的种植经济效益，在云南省滇中地区的江川区、通海县等地广泛引进种植，且种植规模不断扩大[12]。经查阅文献，目前有关火龙珠组织培养鲜见研究报道。无菌苗获得是植物组织培养中一个起始性和关键性的环节，对植物组织培养全过程起着至关重要的作用，亟待开展相关研究。为此，开展火龙珠不同种子无菌萌发的试验研究，拟解决3个关键问题：①火龙珠种子能否在常规培养条件下无菌萌发;②不同时期火龙珠种子无菌萌发情况;③能否通过火龙珠种子无菌萌发建立高效的无菌苗技术体系。通过研究，旨在建立火龙珠种子的高效无菌苗技术体系，为火龙珠的种苗快繁、种质保存、遗传转化及杂交实生苗获得等提供可行的技术途径。

1 材料与方法

1.1 材料

以粉果火龙珠果实内含有的种子为研究对象，火龙珠果实采集于云南省玉溪市江川区火龙珠种植田块。

1.2 方法

1.2.1 果实采集。

按照果实的最大横径（mm）、单果重（g）2个指标将火龙珠果实划分成A、B、C、D 4种类型（图1）。随机采集生长正常、无病虫害发生的4类果实，各类分别采集6个，密封后带回室内处理。

1.2.2 果实灭菌。

摘除果实的叶子和叶柄，先用流水冲洗果实0.5 min，再用洗洁精水浸泡2.5 min后流水冲洗干净，最后于超净工作台上用75%乙醇浸泡消毒30 s后进行果实灭菌。

对4种类型的果实均设计5个灭菌试验处理：处理①（0.20% HgCl2灭菌8 min），处理②（0.20% HgCl2灭菌10 min），处理③（0.20% HgCl2灭菌12 min），处理④（0.20% HgCl2灭菌14 min），处理⑤（0.20% HgCl2灭菌16 min）。

1.2.3 无菌播种。

在超净工作台上，将灭菌后的果实纵切成两半，随机挑取果实内部的种子接入MS培养基中。

1.2.4 种子培养。

种子完成无菌播种后，将种子置于温度（25±2） ℃，光照强度2 000～3 000 lx，光照时间12 h/d的培养室中培养120 d。期间，观察记录种子的颜色变化、萌发、苗生长等数据。

1.3 数据统计与分析

数据统计按以下公式计算：细菌污染率=细菌污染的瓶数/总瓶数×100%;发芽率=发芽的种子数/种子总数×100%;萌发频率=有种子萌发的瓶数/总瓶数×100%;增殖系数=新生的茎段（芽）数/母株的茎段（芽）数×100%。

采用Excel 2003和SPSS 16.0统计软件进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 果实灭菌

不同灭菌处理对火龙珠4种类型果实的灭菌效果差异不明显，各灭菌处理的细菌污染率均为0，成活率均为100%，灭菌效果较好，说明0.20% HgCl2灭菌8～16 min，适宜用于火龙珠的果实灭菌。

2.2 种子的无菌萌发情况

火龙珠不同类型种子无菌萌发的差异明显（表1、图2）。A、B类果实种子萌发频率和发芽率为0;D类果实的种子萌发频率最大，为100%，C类果实的种子萌发频率仅为28.57%;D类果实的种子发芽率、萌发形成的幼苗株高、叶片数、节间距、节段数、增殖系数均显著大于C类果实（P<0.05）;D、C类果实种子萌发形成的幼苗生长势较强，D类在母株幼苗上有明显的增殖分化现象发生，而C类没有增殖分化现象发生（图2）。

2.3 种子萌发的时间动态规律

火龙珠不同种子进行无菌播种后，种子萌发的时间动态规律差异明显（图3）。A、B类果实的种子在120 d内无萌发现象发生;C类果实的种子在第60天后开始萌发，持续时间为30 d，发芽率为1.49%;D类果实的种子在第30天后开始萌发，持续时间60 d，第2个30 d期间的发芽率为3.24%，第3个30 d期间的发芽率为4.57%。D类果实比C类果实的种子发芽起始时间较早，持续时间较长，发芽率较高。由此可知，火龙珠种子的萌发时间为无菌播种后的60～90 d。

3 结论与讨论

外植体灭菌是植物组织培养中重要步骤，其是指用化学药物破坏微生物的细胞结构或使酶类失活，阻止正常代谢而杀死微生物，化学药剂选择和使用方法对外植体的灭菌效果有直接影响[12]。该研究结合多年的组培经验，用0.20% HgCl2灭菌火龙珠果实，不同处理间的灭菌效果差异不明显，但有较好的灭菌效果，细菌污染率为0，成活率为100%，这可能是由于火龙珠果实类型属于蒴果，果实内部的种子处于“无菌”态，只要将果实外部的微生物杀死，且有果实外部的“保护”作用，外部杀伤一定程度上对种子活性影响不大，就会得到理想的灭菌效果。由此说明，蒴果的灭菌时间弹性幅度较大，灭菌较易于操作，这为今后该类外植体的灭菌提供了重要参考，同时也说明对火龙珠果实进行灭菌比较容易，是获得火龙珠无菌外植体的理想途径。

该研究中，不同大小的火龙珠果实代表果实的不同发育时期，A、B、C、D 4类果实分别为幼果、近中年果、中年果、近成熟果。根据植物组培技术的原理[1，13]，理论上A、B、C、D 4类果实的种子都能萌发。但该研究显示，不同火龙珠种子无菌萌发的差异明显，A、B类果实的种子通过无菌播种得不到无菌苗，C、D类果实的种子通过无菌播种能很好地获得健壮的幼苗。这种差异可能是与培养基的成分有关。一般来说，大多数作物种子萌发的适宜培养基是MS，其常用于种子的无菌播种。该研究使用MS培养基对不同的火龙珠种子进行培养，由于A、B类种子未成熟，可能是MS培养基不能促进其萌发，还需加入其他成分（如植物生长调节剂等），这需进行进一步研究。C、D类果实的种子在MS培养基上能萌发出健壮的幼苗，说明火龙珠通过种子无菌萌发建立无菌苗技术体系较容易，且可行。

该研究中，火龙珠D类果实的种子无菌播种到MS培养基上进行培养后出现了明显的增殖现象，这区别于以往的认识：一般来说，在植物组织培养中，须在MS培养基中加入植物生长调节剂（如6-BA、NAA等）后才会有增殖现象发生[1，13]，这可能是由于火龙珠生长分化能力较强;另一方面，在火龙珠A、B、C、D类果实中，D类果实的种子发芽起始时间较早，持续时间较长，相比其他作物的种子无菌发芽率（84.4%～93.0%）[14-15]，其种子发芽率较低，仅为7.81%，但其有100%的萌发频率，一个D类果实中含有很多非常细小的种子，可以播出同D类瓶一样的20～30个无菌瓶（约75粒种子/瓶），每个无菌瓶内的种子萌发形成的幼苗健壮、节段较多，且幼苗有增殖系数为3.67的增殖发生，因此，按这样计算，获得无菌苗是比较高效的。由此可见，该研究通过試验筛选出了适宜的火龙珠果实进行无菌播种，从而成功建立了火龙珠种子的高效无菌苗技术体系。通过该体系，不断增殖无菌苗的茎段或顶芽后完成生根培养就会产生大量的种苗，其成为火龙珠种苗组织培养快繁的重要途径，从而促进火龙珠的生产发展。

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