双特异性磷酸酶在肾脏疾病中的研究进展

杜宇 章波 赵景宏

陆军军医大学第二附属医院肾内科，重庆 400037

蛋白质磷酸化是真核生物蛋白翻译后修饰的重要手段之一，可调节蛋白活性，其广泛地参与了机体内各种生理活动及病理过程。通过特异性的蛋白激酶以及蛋白磷酸酶对蛋白质磷酸化水平的动态调节，使机体内环境趋于稳定。在真核生物中，根据磷酸化作用位点的不同，蛋白磷酸酶可分为酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)以及丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。既往的研究多集中于蛋白酪氨酸激酶，然而近些年，随着对PTPs超家族及其成员的深入研究使得可逆磷酸化在细胞内的严格调控有了进一步的认知，为一些疾病的发生发展及防治策略提供了新的思路。

一、双特异性磷酸酶的分类及特性

DUSPs是PTPs超家族中的一员，因其具有使酪氨酸残基和丝氨酸/苏氨酸残基脱磷酸的双重作用而备受关注。近年来，人类的DUSPs被归属于PTPs扩展家族中cysteine-basedPTPs中的 Ⅰ 型 Ⅱ 亚型，即双特异性VH1样PTPs，其催化域包含有共同的HCxxGxxR位点，共由64个成员组成[1]。该亚型家族包括双特异性MAPK磷酸酶(MKPs，11个)，非典型DUSPs(atypical DUSPs，20个)，丝切蛋白磷酸酶(Slingshots，3个)，肝再生磷酸酶(PRL，3个)，CDC14s(4个)，磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN-like phosphatases，8个)以及肌管素磷酸酶亚家族(MTMs，15个)[1]。MKPs以及大部分非典型DUSPs均表现出对磷酸化的酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸特定的磷酸酶活性，因此被视为狭义上的DUSPs家族成员。

DUSPs之所以归属于PTPs家族，是因其PTPs活性较丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性高40～500倍，且酶活性结构域具有同PTPs相似的结构特征[2]。但DUSPs催化结构域上催化位点的结构深度明显浅于经典PTPs，这使得DUSPs更易识别及接纳包括酪氨酸、丝氨酸以及苏氨酸在内的多个氨基酸残基所连接的磷酸基团[3]。

1.MAPK磷酸酶 MAPK是细胞信号通路的重要组成部分，MAPK的异常调控与多种疾病有关。MAPK家族由细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，c-JNK)以及p38在内的经典成员组成[4]。迄今为止，由于MAPK抑制剂在疾病治疗中疗效的不确定性或存在一定的不良反应，尚无相关药物进入临床Ⅲ期试验[5-6]。而对MAPK抑制剂的研究表明，针对其上游信号分子为靶点的治疗可能比下游更为有效[6-8]。MKPs可通过对MAPK激酶结构域中活化环T-X-Y位点上的苏氨酸和/或酪氨酸去磷酸化，使MAPK失活从而拮抗细胞信号级联反应[9]。MKPs的N端MAPK结合域(MAPK-binding domain，MKB)含有酶相互作用结构域(kinase-interaction motif，KIM)，可与MAPK相作用介导酶-底物的特异性结合，使有活性的MAPK去磷酸化失活，也可使无活性的MAPK失去对外界刺激的反应[10-11]。值得注意的是，典型DUSPs中的DUSP2(PAC1)、DUSP5和DUSP8同样包含KIM却并未命名为MKPs；另有非典型DUSP14(MKP6)和DUSP26(MKP8)虽无KIM，但仍可以使MAPK去磷酸化失活[12]。

根据功能结构域、序列同源性以及亚细胞定位的不同，MKPs又可分为以下三类：(1)定位于细胞核的DUSPs，包括DUSP1(MKP1)、DUSP2(PAC1)、DUSP4(MKP2)和DUSP5(HVH3)，可作用于ERK1/2、p38和JNK蛋白，使其去磷酸化而抑制MAPK所介导的细胞生物活动；(2)定位于细胞质内的DUSPs，包括DUSP6(MKP-3)、DUSP7和DUSP9(MKP4)，它们可以特异性的结合并去磷酸化MAPK家族中的ERK1/2蛋白；(3)可同时定位于细胞质和细胞核的DUSPs，包括DUSP8(M3/6)、DUSP10(MKP5)、DUSP14(MKP6)和DUSP16(MKP7)，对JNK和p38具有更高的特异性[9，13-14]。MKPs对MAPK家族不同成员的特异性选择可能与其所在的细胞类型或MKPs同MAPK相互结合部位的结构差异有关[9]。

2.非典型DUSPs 在20个非典型DUSPs的成员中包含有15个小型非典型DUSPs以及5个其他非典型DUSPs[1]。非典型DUSPs缺少类似MKPs N端所特有的MKB结构域，因此其去磷酸化作用的底物仍不确定。其中DUSP14(MKP6)和DUSP26(MKP8)尚可与MAPK家族成员相互作用并调节MAPK活性。然而，非典型DUSPs更多见于对其他磷酸化蛋白底物的调节，它们甚至可作用于RNA或脂类等非蛋白类底物，进而发挥去磷酸化作用。因此，非典型DUSPs具有更为广泛的底物特异性，并且在生理功能上具有更多的可能性。

二、双特异性磷酸酶与肾脏疾病

DUSPs在肾脏病领域中的研究相对较少，目前已有的研究多集中于糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，亦有少量研究在其他常见肾脏疾病。

1.糖尿病肾病 DN是糖尿病的微血管并发症。高糖、糖基化产物、肾内血流动力学、细胞因子等多种因素均可导致DN中MAPK家族的活化。而MAPK信号通路的激活，尤其是p38和JNK信号途径与DN的发生发展密切相关，且相关研究已多有报道。例如对糖尿病动物模型以及2型糖尿病患者的肾脏组织学分析显示肾小球中p38处于长期激活状态[15-17]，在血压正常的糖尿病大鼠体内，抑制p38的活性可减少蛋白尿和纤维粘连蛋白的产生[18]。Gene 33/Mig-6选择性激活JNK在糖尿病发病早期及持续进展中发挥重要作用[19]。在DN中，尚未完全了解导致MAPK激活的确切机制。然而，鉴于DUSPs是哺乳动物细胞中抑制MAPK的主要调节机制之一[20]，因此，近来一些研究致力于证实DUSPs家族参与了MAPK所介导的DN的发病机制。

大量证据表明，足细胞损伤在肾小球滤过屏障损伤以及DN的发生发展中发挥重要作用[21-22]。亦有临床研究报道，足细胞数量和密度的减少是DN持续进展强有力的预测指标之一[23]。近来有研究报道DUSP4和DUSP26参与了足细胞损伤致DN的发病机制。DUSP4(MKP2)是双特异性MAPK磷酸酶，NLS1和NLS2是其定位于细胞核中的核定位序列[24]。DUSP4可因生长因子、细胞应激、紫外线和LPS等诱导产生，并使JNK、p38和ERK去磷酸化失活[25-29]。其中Benoit Denhez等[30]的研究证实了高糖培养的足细胞以及糖尿病小鼠和患者肾组织中DUSP4表达下降。在糖尿病小鼠中，DUSP4表达丧失导致p38和JNK的持续活化、氧化剂产生和细胞死亡，从而导致肾小球损伤、足细胞足突消失、功能障碍。对糖尿病患者肾皮质中DUSP4的表达分析同样证实，DUSP4 mRNA表达降低与患者eGFR下降相关[<60 mL·min-1·(1.73 m2)-1]。因此，阻止DN中DUSP4表达下降可能是延缓DN进展的新靶点[30]。DUSP26(MKP8)是分子量约24 kDa的非典型DUSPs，同样具有使MAPK失活的作用。据报道，DUSP26可以抑制p38磷酸化，从而阻断p38介导的肿瘤细胞的凋亡[31]。而抑制DUSP26的表达可以促进MAPKs(p38/JNK)的活化，从而加速脂肪肝的进展[32]。Huang等[33]的研究发现DN患者肾脏中DUSP26表达增加。采用DUSP26基因敲除小鼠(DUSP26-/-)进一步观察到肾损伤、肾小球硬化，Nephrin表达降低以及肾小球基底膜增厚。此外，在DUSP26-/-小鼠中，通过促进转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表达，链脲佐菌素诱导的DN肾小球纤维化明显加重；而减少活性氧的产生可消除DUSP26-/-小鼠中TGF-β1表达的增加和MAPKs的活化，从而保护足细胞免受高糖诱导的损伤[33]。以上研究表明，DUSPs通过选择性抑制MAPK家族成员可能是参与介导足细胞损伤在DN发病机制中的重要途径之一。

DUSP1(MKP1)是DUSPs家族首个被鉴定且研究最为广泛的成员，可在多种组织细胞中表达并参与细胞死亡、癌症、炎症以及代谢性疾病等多种生物学事件。体内、外研究表明，DUSP1以细胞类型依赖的方式可使JNK、p38和ERK脱磷酸化，与JNK和p38的结合较ERK具有更强的亲和力[34]。在DN中肾脏固有细胞存在线粒体自噬功能异常以及能量代谢、生物合成、动力学紊乱，表明线粒体功能损伤亦与DN发病及进展有关[35-37]。近来有多个研究报道了MKP1与线粒体功能失调在糖尿病肾损害中的详细作用。Zhang等[38]的研究表明在高糖应激下，MKP1缺乏可促进线粒体损伤和肾小球系膜细胞凋亡。在此过程中，线粒体片段化是传递和放大损伤信号以启动肾小球系膜细胞死亡必不可少的元素。而过表达MKP1可通过抑制JNK-钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ-线粒体分裂蛋白1信号途径(JNK-CaMKⅡ-Fis1 pathway)和稳定线粒体功能逆转上述现象[38]。同样Sheng等[39]的研究重点介绍了DUSP1通过调节线粒体稳态来控制DN进展的新途径，即高糖诱导的DUSP1下调可激活JNK途径，开启线粒体裂变因子介导的线粒体裂变，该线粒体动力学的不平衡进一步加重了肾损害。这些研究表明，DUSP1在线粒体功能损伤致DN发生发展的分子机制中具有重要意义，以DUSP1-JNK信号途径为核心的调控作用参与了这一过程，这为DN的治疗开辟了新的思路。

2.高血压肾病 肾脏既是高血压损害的重要靶器官之一，又是导致高血压的重要组织器官。DUSP1除在DN中发挥作用外，Chen等[40]对高血压肾病基因表达谱数据分析后同样发现DUSP1表达下降，这在血管紧张素Ⅱ处理HK-2的细胞模型中也得到证实。DUSP5(hVH3)是一种核MKP，在哺乳动物细胞内可由热休克蛋白和生长因子所诱导，能同MAPK家族中的ERK特异性结合使其发生核转位和失活[41]。DUSP5可被泛素化蛋白酶体降解，其降解会增强ERK信号传导的幅度和持续时间[42]。相反，ERK可通过抑制DUSP5泛素化来维持DUSP5稳定，该调节独立于ERK激酶活性，但取决于ERK-DUSP5的相互作用[43]。目前尚未广泛研究DUSP5对肾脏疾病可能带来的影响。Zhang等[44]的研究证实DUSP5-/-大鼠引起PKCα和ERK1/2激活，进而增强肾入球小动脉和小叶间动脉的肌反应性。在醋酸去氧皮质酮-盐(DOCA-salt)高血压大鼠模型中，敲除DUSP5可改善肾血流量对高血压的自动调节能力，减少蛋白尿。DUSP5-/-大鼠还可降低肾脏中MCP-1的表达，减少巨噬细胞浸润，并下调TGF-β1、MMP2和MMP9的表达，抑制上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和肾纤维化。因此，抑制DUSP5可通过增强肾血管反应性和加强肾血流自动调节能力来预防高血压肾损伤的发生[44]。值得一提的是，MKPs是多数肾脏疾病进程中负向调控的重要分子。而在Zhang等[44]的研究中，DUSP5基因敲除大鼠在高血压肾病中显示了一定的保护作用。这可能归咎于不同的MKPs亚型选择作用于MAPK家族不同成员，其在某一特定的疾病模型中所具有的作用表现。在血管平滑肌细胞中，ERK1/2和PKC磷酸化可通过激活瞬时受体电位、上调细胞内钙水平、活化钙调蛋白结合蛋白等方式来加强血管反应性，改善肾血流量对高血压的自动调节能力，从而减少炎性细胞因子和促纤维化介质的产生[44]。因而Zhang等[44]的研究中DUSP5显现了不同于多数MKPs亚型的效应表现，这与ERK蛋白在高血压肾病中的功能不可分割。而更多的DUSPs家族成员在高血压肾病发生发展中的作用机制还有待于进一步研究。

3.急性肾损伤 急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是多种病因引起的肾功急剧下降的危急重症。其中肾缺血再灌注损伤是引起AKI的重要原因之一，然而迄今为止缺血再灌注损伤所涉及的病理生理机制尚未完全阐明。Chang等[45]利用DNA芯片技术分析了缺血再灌注损伤大鼠模型中肾脏的基因表达谱，发现在缺血再灌注损伤组与MAPK途径相关的DUSP1存在显著上调，且通过定量聚合酶链反应进一步确认DUSP1 mRNA表达水平与其一致[45]。因此，对于新的DUSPs关键分子及其作用机制的进一步探索对AKI的预防及治疗具有积极的意义。

4.慢性肾脏病 慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)发病率逐年递增，肾小球硬化以及肾间质纤维化是CKD进展至终末期肾病的共同病理表现，早期干预可明显延缓CKD进程，降低并发症发生率以及病死率。因此，对其预测因子及发病机制的深入研究具有重要的临床价值。Li等[46]的研究发现在单侧输尿管结扎大鼠模型的肾小管上皮细胞以及TGF-β1诱导的NMT-52E细胞的EMT过程中MKP2(DUSP4)的表达上调。MKP2可抑制JNK信号传导并部分逆转TGF-β1所诱导的EMT；相反，抑制MKP2可促进上皮钙黏素、α-平滑肌肌动蛋白表达以及纤维粘连蛋白的分泌，这一过程可被JNK抑制剂所拮抗[46]。以上这一研究是基于DUSP4所参与的肾小管上皮细胞间充质转分化致肾纤维化发生发展这一经典机制展开。然而，细胞凋亡、炎症反应、TGF-β1/Smad信号途径等多种重要的肾脏纤维化病理过程中，又有哪些DUSPs家族成员参与其中亟待更多的研究探讨。

三、小结

DUSPs作为一种酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸双特异性磷酸酶而备受瞩目。既往DUSPs研究多集中在炎症及肿瘤领域，深入了解DUSPs家族中各成员在肾脏疾病中的作用及调控机制，将有助于为肾脏病的防治提供新思路。因此，DUSPs家族在肾脏领域将是一个值得重视及深入探索的新靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突