河南大豆新品系抗大豆疫霉根腐病基因鉴定

张雪翠 孙素丽 卢为国 李海朝 贾岩岩 段灿星 朱振东,*

1 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 2 河南省农业科学院经济作物研究所, 河南郑州 450002

大豆[Glycine max(L.) Merrill]含有丰富的蛋白质、油脂和人体所需要的多种微量元素, 是世界上重要的粮食作物和经济作物。我国是大豆主要生产国, 目前生产规模居世界第5位[1]。在生产中, 病害是制约大豆产量的重要因素, 其中由大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是破坏性的大豆病害之一, 广泛发生于世界各主要大豆产区, 严重影响大豆的产量和品质[2]。在中国, 大豆疫霉根腐病首先于1989年在东北被发现[3], 随后该病害的发病区域不断扩大, 成为影响我国大豆生产的主要病害[4-5]。

大豆疫霉是一种土传性病原菌, 通过土壤、水流等进行传播和蔓延, 其卵孢子可以在土壤中存活数年, 在高湿度条件下卵孢子萌发形成孢子囊,遇水释放游动孢子侵染植株。大豆疫霉在大豆的整个生育时期都能侵染, 导致出苗前和出苗后死亡、苗期猝倒或成株期根茎腐。目前, 培育和种植抗病品种是控制大豆疫霉根腐病最为有效、经济和环境友好的方法[2,6]。大豆对大豆疫霉的抗性包括由单个显性基因控制的质量抗性和由多个微效基因控制的数量抗性, 其中质量抗性为研究的重点[7]。目前, 国内外已在大豆 2号、3号、7号、10号、13号、14号、16～19号染色体上鉴定了30多个抗疫霉根腐病基因[2,8-10]。大豆与大豆疫霉的互作符合基因对基因的关系, 在抗病品种选择压力下, 大豆疫霉容易产生新的毒力型, 从而导致抗病品种的抗性丧失[11-13]。因此, 需要不断培育和利用新的抗病品种。

河南省近年来大豆种植面积约 57.33万公顷,位居全国第 4位[14], 在悠久的大豆栽培过程中,通过与病原菌的相互作用及人为选择, 河南大豆蕴藏了丰富的抗病性资源。国内外研究表明, 河南大豆品种及资源普遍存在对大豆疫霉根腐病的抗性[15-16], 其中许多品种具有广谱的抗病性。目前,部分河南大豆品种所含的优异抗疫霉根腐病基因已被鉴定[17-19]。大豆品种郑97196是国内筛选到的大豆疫霉根腐病优异抗源之一[17,20]。张海鹏等[19]将郑97196抗大豆疫霉根腐病基因初步定位在大豆3号染色体上, 定名为RpsZheng。最近, 我们对郑97196抗疫霉根腐病基因RpsZheng进行了精细定位, 并开发了一个能够有效检测该基因的共分离InDel标记 WZInDel11[21]。

虽然河南省尚未有大豆疫霉根腐病严重发生的报道, 但有研究证明该地区存在大豆疫霉及致病型多样性, 并且与其临近的山东省、安徽省均有大豆疫病发生的报道, 表明具有大豆疫霉根腐病发生的潜在威胁[4,22]。目前, 河南省有目的抗疫霉根腐病的大豆育种尚未开展, 新育成的品系对大豆疫霉根腐病的抗性及基因型不明确, 因此, 在生产上推广利用存在大豆疫霉病发生的风险。本研究对64个河南省新育成的大豆品系进行大豆抗疫霉根腐病鉴定,并利用RpsZheng的共分离标记进行抗病基因检测,旨在为这些品系的推广利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

64个河南大豆新品系、感病对照品种Williams和抗病品种郑 97196分别由河南省农业科学院经济作物所和中国农业科学院作物科学研究所提供(表 1)。

1.2 大豆疫霉

大豆疫霉分离物 Ps41-1由本实验室分离保存,PsJS2由南京农业大学王源超教授提供(表1)。Ps41-1为我国东北地区大豆优势毒力分离物(毒力型: 1a,1b, 1d, 2, 3a, 3b, 3c, 4, 5, 6, 7, 8), PsJS2为强毒力分离物(毒力型:1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 2, 3a, 3b, 3c, 4, 5, 6, 7,8), 所有的大豆疫霉分离物使用时均在 V8汁琼脂培养基上活化[23], 在24℃培养8～10 d, 用于接种。

1.3 抗病性鉴定

分别选取抗病对照郑97196、感病对照Williams以及 64个河南大豆新品系 15粒种子, 播种在以蛭石为基质的1000 mL的纸杯中, 播种后在25℃温室培养; 每个品系播种 2杯, 分别用于接种大豆疫霉分离物Ps41-1和PsJS2。待植株第1对真叶展开后,采用下胚轴创伤接种法进行抗性鉴定[18], 接种时,先用注射器针头在大豆植株子叶下方1 cm处下胚轴划一道长约1 cm的伤口, 再用注射器在伤口处注射约 0.2 mL的接种体。接种后的植株置于温度为23～25℃、湿度为100%的保湿间内保湿48 h, 然后转入25℃温室内继续培养3 d后进行表型调查[24-25]。抗性评价参照钟超等[26]的标准, 每个品种的死亡率小于或等于 30%, 记为抗病(resistant, R); 植株死亡率在30%～70%之间, 记为中间类型(intermediate, I);植株死亡率大于或等于 70%, 记为感病(susceptible,S)。试验重复2次。

1.4 大豆基因组DNA的提取

分别等量采集每个大豆品系 10株健康幼嫩叶片, 混合于2 mL试管中用于大豆基因组DNA的提取。采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱)(天根生物科技有限公司, 中国北京)提取大豆基因组DNA, 具体步骤参照试剂盒的使用说明。

1.5 标记鉴定

用郑97196大豆抗疫霉根腐病基因RpsZheng的共分离标记 WZInDel11进行大豆品系分子标记检测[21]。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成InDel标记。PCR反应体系为10 μL, 包含上下游引物各 0.2 μL、2 ×TaqPCR MasterMix (天根生物科技有限公司) 4 μL、模板 DNA 2 μL (20 ng), dd H2O 补足至10 μL。反应程序为94℃预变性5 min; 94℃变性45 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 35个循环; 72℃延伸10 min, 4℃保温。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测[21]。

2 结果与分析

2.1 抗病性鉴定

抗病性鉴定结果表明, 感病对照品种 Williams对 2个大豆疫霉分离物均表现为感病, 抗病对照品种郑97196对2个大豆疫霉分离物均表现为抗病。图1显示了鉴定的64个大豆新品系对2个分离物的抗、感反应比例。表1列出了每个品系对2个大豆疫霉分离物的抗性反应型。64个新品系中, 对大豆疫霉分离物Ps41-1和PsJS2表现为抗病的分别有35个和 16个, 分别占 54.7%和 25.0%, 对 Ps41-1和PsJS2表现为中间反应的分别有16个和10个品系,分别占25%和15.6%; 对Ps41-1和PsJS2表现为感病的分别有 13个和 38个品系, 分别占 20.3%和59.4%。洛豆 16106、开豆 1106、郑豆 1304、洛豆16095、周豆47、郑豆1526、周豆43、周豆45、郑1307、周豆 38、安豆 5919、安豆 6223、周豆 37、安豆1498、郑1807、漯8826共16个品系同时抗2个大豆疫霉分离物 Ps41-1和 PsJS2, 占鉴定品系的25% (表 1)。

2.2 标记基因型鉴定

张雪翠等[21]开发了一个广谱抗大豆疫霉根腐病基因RpsZheng的共分离标记WZInDel11, 本研究利用该标记对64个品系进行RpsZheng基因检测(表1和 图2)发现, 洛豆 16106、郑豆1304、洛豆16095、周豆47、郑豆1526、周豆43、周豆45、郑1307、安豆5919、安豆6223、周豆37、郑1807、周豆38、漯 8825、驻豆 37、泛豆 22、郑 15234、漯豆 8816共18个大豆品系含有WZInDel11标记, 占检测总数的28.1% (表1)。其中有5个对1个或2个分离物表现为抗感分离的中间型品系(郑15234、漯8825、漯豆8816、驻豆37和泛豆22)出现了杂合基因型(表1和图 2), 表明基因型与表型结果相一致, 也表现为抗感分离。

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本研究进一步利用标记WZInDel11对出现杂合基因型的漯豆8816的6个感病单株和4个抗病单株进行分子检测表明, 6个感病单株均扩增出了WZInDel11的感病目标片段, 而 4个抗病单株有 2个单株扩增出了WZInDel11的抗病目标片段, 另外2个抗病单株扩增出了抗病和感病目标片段, 其基因型表现为抗、感分离的杂合基因型(图3)。表明表型为抗病的单株基因型存在纯合抗病及抗感分离杂合基因型。

3 讨论

本研究对河南省近年来新培育的64个大豆品系进行对2个大豆疫霉分离物的抗性鉴定发现, 有51个品系对1个或2个大豆疫霉分离物表现为抗病或中间反应, 将中间反应型归为抗病反应[18,26], 抗病品系占鉴定品系的 79.7%, 这表明河南省近期育成的大豆新品系继续保持对大豆疫霉根腐病高水平的抗性[20]。

采用对大豆疫霉根腐病具有广谱抗性基因RpsZheng的共分离标记WZInDel11对64个品系进行抗病基因的分子检测发现, 周豆37、周豆38、周豆43、周豆45、周豆47、郑豆1304、郑1307、郑豆 1526、郑15234、郑 1807、漯 8825、漯豆8816、洛豆 16095、洛豆 16106、安豆 5919、安豆 6223、驻豆 37、泛豆 22共 18个大豆品系中检测到WZInDel11的抗病目标片段。WZInDel11为RpsZheng基因的共分离标记, 我们的前期研究表明,携带Rps1c、RpsYD25和RpsYD29基因的大豆品种也含有该标记[21], 因此 WZInDel11标记可以作为Rps1基因座部分等位基因或紧密连锁基因的检测标记[18](钟超, 未发表数据), 通过抗性反应型和系谱分析推测出含有 WZInDel11标记的大豆品种(系)的抗疫霉根腐病基因。本研究发现, 所有含有WZInDel11标记的品系对2个大豆疫霉分离物均表现为抗病型, 表明一些品系含有相同的抗疫霉根腐病基因。漯8816和漯8825的父本均为郑97196, 抗病基因应该来源于郑97196, 表明2个品系所含基因为RpsZheng[21]。豫豆 29为洛豆 16106和郑 15234的亲本之一, 2个品系的抗性应该起源于豫豆29, 因此含有RpsYD29[18]。郑豆1526、郑豆1304和郑1307的亲本之一为郑9805, 郑9805由豫豆23和豫豆22杂交育成, 推测这 3个品系的抗病基因来源于豫豆23, 含有RpsZheng或其等位基因[21,28]; 周豆47的亲本之一为皖宿2156, 而皖宿2156由中作975和豫豆23 (郑交8739-47)杂交育成, 因此, 周豆47的抗病基因应该来源于豫豆23, 推测其含有RpsZheng或等位基因[21,29]。周豆37、周豆38、郑1807、周豆43和周豆45亲本之一为周豆23或菏豆20, 这2个品种与郑97196、豫豆23和豫豆25具有共同祖先, 推测这些品系含有RpsZheng、RpsYD25、RpsYD29或新的等位基因[21,27,30], 安豆6223和安豆5919的一个亲本为安豆5156, 安豆5156以周9521-3-4为母本、获黄三选-3为父本杂交育成[31], 周 9521-3-4与郑97196、豫豆 29具有相同的抗大豆疫霉谱和相同的Rps1基因座单倍型[32], 因此, 我们推测, 安豆 6223和安豆5919可能含有RpsZheng或RpsYD29。驻豆37、洛豆10695和泛豆22的亲本与郑97196、豫豆23、豫豆25、豫豆29的亲缘关系不明确, 推测含有新RpsZheng等位基因。

大豆疫霉分离物 PsJS2为江苏省分离到的强毒力分离物, 能够克服除Rps9、RpsQ、RpsHC18、RpsX、RpsZheng以外的其他已知抗疫霉根腐病基因, 因此,对 PsJS2表现抗病的大豆品种(系)很可能含有新的基因。本研究抗性鉴定结果表明, 开豆 1106、郑1659、漯豆 8826、宛黄 7号、郑 1227、郑 1205、安豆 1498对 2个大豆疫霉分离物 Ps41-1和 PsJS2都表现为抗病反应或中间反应型, 但分子检测这些品系中不含有WZInDel11抗病目标片段, 表明这些品系可能含有新的广谱抗疫霉根腐病基因。最近,张志民等[33]鉴定77份大豆品种(系)对8个大豆疫霉菌株的抗性反应发现, 安豆1498是唯一一个对8个分离物表现为抗病的品系, 推测其可能携带新的抗病基因或新的抗病基因组合。本研究也发现, 安豆1498是唯一一个对 2个大豆疫霉分离物 Ps41-1和PsJS2均表现为纯合抗病反应(植株死亡率为 0)但不携带 WZInDel11抗病目标片段的品系, 同样, 我们也推测, 安豆1498可能含有新的抗病基因或新的抗病基因组合。根据朱振东等[17]的研究结果, 本研究中开豆1106的父本豫豆19与郑97196对10个具有不同毒力的大豆疫霉菌菌株具有相同的反应型, 而SSR分析表明, 豫豆19与本研究中安豆5156的父本周9521-3-4具有很近的遗传关系[31], 周9521-3-4与郑97196、豫豆29具有相同的抗大豆疫霉谱和相同的Rps1基因座单倍型[31-32], 表明开豆 1106可能含有RpsZheng座位的新等位基因。

大豆对大豆疫霉根腐病的抗性存在由显性单基因控制的质量抗性和由多基因控制的数量抗性 2种类型。由于质量抗性表现为完全抗性、容易利用和检测, 国外大豆抗疫霉根腐病育种主要利用质量抗性[34]。下胚轴创伤接种是鉴定大豆对大豆疫霉根腐病质量抗性的主要方法[24-25]。抗性纯合的大豆品种理论上接种非亲和大豆疫霉分离物后的死亡率为 0,但在实际中大豆品种特别是大豆资源, 可能存在混杂或抗性分离而导致部分植株死亡, 因此绝大多数研究中将植株死亡率小于或等于 30%的品种或资源划分为抗病, 死亡率在 31%～69%的归为中间类型。由于中间类型品种中存在大量的抗性植株, 因此, 对大豆疫霉特别是对其强毒力分离物表现为中间类型的优异大豆品种或资源同样具有重要的利用价值。

河南省具有丰富的抗大豆疫霉根腐病资源, 大多数骨干亲本都具有对大豆疫霉的广谱抗性[20]。因此, 河南育成的大豆品种大多对大豆疫霉具有高水平的抗性, 然而由于大豆疫霉根腐病抗性不是大豆育种的目标性状, 育成的大豆品种或多或少出现抗性分离。在本研究中, 分别有 16个和 10个品系分别对大豆疫霉分离物Ps41-1和PsJS2表现为中间反应类型, 其中郑1801对2个分离物均表现为中间类型, 表明这些品系存在抗性分离。本研究发现对 1个或2个大豆疫霉分离物表现为中间反应型的5个的大豆品系, 分别为漯8825、驻豆37、泛豆22、郑15234和漯豆 8816, 分子检测结果表明其为杂合基因型, 进一步从分子水平证明了这 5个品系存在抗性分离(图2)。抗性分离品系的单株分子标记检测结果表明, 表型为抗病的植株基因型表现为纯合抗病和抗感杂合的2种类型(图3)。这些抗性分离的品系通过 1～2轮抗性植株的接种选择, 便可选育成纯合抗病品系, 或利用抗病基因连锁的共显性分子标记WZInDel11直接鉴定纯合抗性植株, 从而快速选育成纯合抗病品系推广利用。

4 结论

通过对河南省新培育的 64个大豆品系进行抗大豆疫霉根腐病鉴定发现, 有 51个抗病品系, 占鉴定品系的 79.7%, 利用抗疫霉根腐病基因RpsZheng的共分离标记WZInDel11进行分子检测,鉴定了18个含有RpsZheng或等位基因的大豆品系,研究结果可为近期培育的大豆新品系的推广和利用提供参考。