长丰地区南瓜白粉病病原菌生理小种鉴定

夏伟伟 邓竹根 戴祖云 韦小飞 李曼

摘    要：为明确安徽省合肥市长丰地区南瓜白粉病病原菌种类及其生理小种，于2020年春季在长丰县吴山镇、水湖镇、岗集镇、造甲乡等地采集16份白粉病病原菌。通过观察病原菌的形态，并以长丰县吴山地区的白粉病菌总DNA为模板扩增其rDNA内转录间隔区（ITS）序列，经过测序比对，推断其为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）。最后采用国际公认的13个甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主进行接种，根据抗感反应，确定长丰地区南瓜白粉病病原菌生理小种为Podosphaera xanthii race 1。初步明确了2020年春季合肥长丰地区南瓜白粉病病原菌的生理小种，为下一步该地区南瓜抗白粉病新品种选育奠定了基础。

关键词：南瓜;白粉病菌;生理小种;鉴定

中图分类号：S642.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）11-024-06

Identification of physiological race of pumpkin powdery mildew in Changfeng region

XIA Weiwei1， DNEG Zhugen1， DAI Zuyun1，2， WEI Xiaofei1， LI Man2

（1. Anhui Jianghuai Hortriculture Seeds Co.， Ltd.， Hefei 230031， Anhui， China; 2. Anhui Agricultural University， Hefei 230036， Anhui， China）

Abstract： In order to verify the species and physiological races of pumpkin powdery mildew in Changfeng region， Hefei City， Anhui Province. In the spring of 2020， a total of 16 powdery mildew pathogens were collected in Wushan， Shuihu， Gangji， and Zaojia in Changfeng region. Through morphological observation， and using powdery mildew DNA from Wushan area of Changfeng region as a total DNA template to amplify its rDNA internal transcribed spacer （ITS） sequence. After sequencing and comparison， it was inferred to confirm that it was Podosphaera xanthii. Then the 13 internationally recognized  race differenciation host were used to identify the races. Based on the resistance to susceptibility， Podosphaera xanthii physiology race 1 was determined as the pathogenic physiology race of pumpkin powdery mildew in Changfeng region on the spring of 2020. In this study， we had identified the physiological races of powdery mildew pathogen of pumpkin in Changfeng area of Hefei in the spring of 2020， which laid a foundation for breeding new varieties of pumpkin resistant to powdery mildew in this area.

Key words： Pumpkin; Powdery mildew; Physiological race; Identification

南瓜屬于葫芦科（Cucurbitaceae）南瓜属（Cucurbita）一年生蔓生草本植物，营养丰富，具有药用和食用价值[1]。南瓜原产于墨西哥到中美洲一带，明代传入中国，并被广泛种植。南瓜在生长周期内易受多种病害侵染，白粉病是主要病害之一。白粉病在南瓜生长中后期发病，后期植株叶片布满白粉病病菌孢子，形成一层厚厚的白粉层，严重阻碍植物进行光合作用，导致果实减产、品质下降[2-4]。

瓜类白粉病病原菌主要有3个属6个种：白粉菌属（Erysiphe）、内丝白粉菌属（Leveillula）及单囊壳属（Podosphaera），6个种分别是白粉菌属4个，为E. cichoracearum、E. communis、E. polygoni和E. polyphaga;内丝白粉菌属1个，为L. taurica;单囊壳属1个，为 P. xanthii [5]。其中对P. xanthii研究最多，已发现其有11个生理小种，分别是生理小种 0、1、2 US、2 France、3、4、5、N1、N2、N3和N4[6]。

白粉病病原菌主要是通过形态观察、ITS rDNA序列分析及鉴别寄主抗感反应的方法进行鉴定。张怡等[7]利用形态观察及 ITS rDNA 序列分析方法鉴定河南省周口市和商丘市的瓜类白粉病病原菌，结果表明白粉病病原菌均为Podosphaera xanthii。肖仲久等[8]利用同样的方法对贵州省贵阳市、遵义市、六盘水市以及安顺市南瓜白粉病菌进行鉴定，结果表明，白粉病病原菌均为 Podosphaera xanthii 。李苹芳、苏瑞、刘东顺等[9-10]采用国际通用13个甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主对不同地区的白粉病菌进行鉴定，确定江浙沪和新疆地区生理小种分别为race1、race5，甘肃地区白粉病生理小种为2 Frace和N2。屈淑平等[1]通过形态观察、ITS rDNA序列分析方法及甜瓜生理小种鉴别体系抗感反应表现，鉴定出黑龙江地区白粉病病原菌为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii），生理小种为2 France。

近几年来，由于南瓜的经济效益逐年提高，特别是西洋板栗小南瓜口感、风味及营养价值高等特点，加上政府财政支持，长丰县种植面积达到667 hm2。为调查长丰地区侵染南瓜白粉病病原菌种类及生理小种，笔者通过对长丰地区白粉病病原菌形态结构观察、分析白粉病病原菌ITS序列，同时采用国际通用的13个甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主试验，以确定长丰地区病原菌种类及其生理小种，为该地区南瓜抗白粉病新品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采用国际通用鉴别寄主：Iran H、Top mark、Vedran-tais、PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI 414723、MR1、PI 124111、PI 124112、PMR6、Nantais 和Oblong，由淮北师范大学、武汉市农业科学院和东北农业大学惠赠。白粉病寄主选用易感病南瓜自交系5802，由安徽江淮园艺种业股份有限公司提供。南瓜自交系5802于2020年春季种植在合肥市长丰县吴山镇江淮园艺农业示范园，用于病原菌分离与鉴定。甜瓜鉴别寄主于2020年秋季种植于合肥市长丰县吴山镇江淮园艺农业示范园大棚。甜瓜鉴别寄主白粉病的抗感反应见表1。

于2020年春季在长丰县吴山镇、水湖镇、岗集镇和造甲乡等地采集16份自然发病的南瓜植株叶片。

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌分离纯化 参照屈淑平等[1]的方法，将2020年6月中旬收集的白粉病菌分离纯化，将纯化后的单菌落置于吐温-20溶液中，制成浓度为2.5×105～5.0×105个·mL-1孢子悬浮液，通过喷雾法对生长至2片真叶的健康南瓜幼苗进行接种，置于28 ℃、湿度80%环境中培养，经4次分离纯化后利用易感病南瓜植株扩繁，活体保存，用于后续试验。

1.2.2 白粉病病原菌形态观察 参照王佩铃等[11]、梁巧兰等[12]方法，观察白粉病病菌分生孢子特征。

1.2.3 致病性检测 按照科赫氏法则检验白粉病病原菌致病性。参照屈淑平等[1]的方法，取分离纯化后南瓜叶片白粉菌于吐温-20溶液中，制成2.5×105～5.0×105个·mL-1孢子悬浮液。种植30株南瓜幼苗。当植株长至2片真叶时，取15株幼苗喷施孢子悬浮液于南瓜叶片上，15株幼苗喷施滴加吐温-20的无菌水溶液作对照。置于28 ℃、湿度80%环境中培养，观察植株发病情况。

1.2.4 白粉病病原菌分子鉴定 南瓜白粉病病原菌总DNA提取采用天根植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）。以南瓜白粉病病原菌总DNA为模板，利用真菌核糖体ITS区段通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增。PCR 体 系 为 20 μL：10× Buffer 2 μL，dNTP 0.2 μL，上下游引物各1.0 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 14.6 μL，DNA模板1.0 μL。反应条件为：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共32个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并进行纯化。把纯化的PCR产物送上海英潍捷基生物公司测序。将南瓜白粉病病原菌ITS序列在NCBI核酸数据库进行比对，利用软件Lasergene进行序列处理、分析。采用MegAlign方法进行多序列比对并构建系统发育树。

1.2.5 白粉病病原菌生理小种鉴定 甜瓜白粉病病原菌13个鉴别寄主分别播种于12 cm×12 cm塑料花盆中，在4叶1心期进行喷雾接种，接种浓度为105个·mL-1，每个材料接10株苗，3次重复。接种后放置于长1.5 m、宽0.4 m、高1.8 m的2层不锈钢架内，架子四周与顶部用塑料薄膜封闭，架子置于组培室内。使用空调及加湿器，控制温度28 ℃、湿度80%，接菌 15 d 后觀察鉴别寄主发病情况。鉴定标准见表1，病情指数（DI）计算参照文献[1]见表2。

病情指数（DI）计算如下：DI=Σ（sini）·（5N）-1·100。式中，si为发病等级，ni为相应发病等级植株数目，N为调查总株数观测量。0

1.3 室内分子鉴定及小种鉴定

白粉病病原菌分离纯化、形态观察、分子及小种鉴定试验于2020年6—8月在安徽省合肥市长丰县吴山镇桥冲村江淮园艺示范园分子实验室进行。

2 结果与分析

2.1 南瓜白粉病病原菌的形态鉴别

将采集的16份南瓜白粉病病原菌分别进行显微观察，结果显示，视野下不同来源的白粉菌分生孢子均呈广椭圆形，内含多个纤维状体，且串生成念珠状，其分生隔膜有2～4个（图1）。可初步判定，16份南瓜白粉病菌都是单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.2 病原菌致病性检测

将长丰吴山地区的白粉病病原菌分离纯化，纯化后白粉病病原菌制作成悬浮液，采用喷雾接种法接种于5802南瓜幼苗叶片上。15 d后南瓜叶片表面出现小的圆形白色粉状斑点，25 d后植株叶片白粉斑点扩散变大直至布满整个南瓜叶片，发病状态与自然发病情况相似（图2）。再次观察白粉病病原菌形态，发现其分生孢子、纤维状体等形态特征与自然发病植株表现一致。结果表明，长丰吴山地区纯化的白粉菌为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）。其余3个地区检测方法一致，显示均为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）。鉴定结果表明，16份白粉病病原菌均为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.3 病原菌的分子检测

以长丰吴山地区南瓜白粉菌总DNA为模板，用通用引物 ITS1、ITS4 进行扩增。经电泳可见一条约为564 bp的特异性条带（图3）。

该特异性条带经纯化测序，在NCBI上进行BLAST比对分析，同时运用软件Lasergene MegAlign将序列与不同地区、不同作物的白粉菌序列进行比对，结果表明，该南瓜白粉菌序列与Podosphaera xanthii序列一致性高达95%，同源性较高（图4）。运用软件Lasergene MegAlign建立系统发育树（图5），结果发现，南瓜白粉菌ITS序列与长寿花单囊壳（Podosphaera xanthii-KB）、茄子单囊壳（Podosphaera xanthii-SM）、番茄单囊壳（Podosphaera xanthii-SL）等亲缘关系较近。其余3个地区检测方法一致，显示均与Podosphaera xanthii序列一致性在95%～98%。结果表明，长丰地区的南瓜白粉病病原菌为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.4 南瓜白粉病病原菌生理小种的鉴别结果

采用孢子悬浮液喷雾法，将长丰吴山地区白粉病病原菌纯化后接种于13个国际通用鉴别寄主叶片上，观察分析寄主的抗感反应（表3）。观察发现，鉴别寄主Iran H 、Top-mark、Vedrantais、 Nantais Oblong接种白粉菌15 d发病，出现肉眼可见近圆形粉状斑点;25 d充分发病，整株植物叶片及茎干布满白粉，感病严重。而寄主PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI 414723、MR1、PI 124111、PI 124112、PMR6均表现为抗病。鉴定结果表明，长丰吴山地区南瓜白粉病病原菌生理小种是Podosphaera xanthii中的race1（表1～2）。其余3個地区白粉病病原菌采用同样鉴定方法，显示南瓜白粉病病原菌生理小种均为Podosphaera xanthii中的race1。结果表明，长丰地区16份白粉病病原菌生理小种均为Podosphaera xanthii中的race1。

3 讨论与结论

单囊壳白粉菌属于白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae）单囊壳属（Podosphaera），其寄主广泛[1]。白粉病病原菌可通过分生孢子和分生孢子梗进行形态学鉴定，根据分生孢子内是否含有纤维状体判断其是否为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）[1，13-14]。笔者观察视野下不同来源的白粉菌分生孢子均呈广椭圆形，内含多个纤维状体，且串生成念珠状，其分生隔膜有2～4个不等，判断其均为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）。

rDNA内转录间隔区（ITS）序列分析广泛应用于病原菌分类[15-16]，通过rDNA内转录间隔区（ITS）序列分析表明，本试验中白粉菌与Podosphaera xanthii聚类在同一分支，结果进一步证明长丰地区南瓜白粉病病原菌为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）。

笔者运用了形态学观察、分子鉴定以及国际通用甜瓜白粉病菌生理小种鉴别方法对安徽合肥长丰地区2020年春季南瓜白粉病病原菌进行鉴定，确认其为单囊壳白粉菌的race1。白粉病病原菌生理小种多样，而且分化速度快。同种作物不同时期生理小种不同[17-18]，同时露地和大棚生长环境的不同导致同种作物生理小种也不同[19]。因此，下一步要针对长丰地区南瓜不同种植环境、不同季节的白粉病病原菌进行监测，以更好地掌握当地白粉病生理小种变化情况，为南瓜抗白粉病选育提供依据。

笔者通过多种方法初步确定了长丰地区南瓜白粉病病原菌为单囊壳白粉菌的race1，并没有发现其他生理小种，为长丰地区南瓜抗白粉病选育及种质资源相关研究提供了依据。

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