‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中质地与解剖结构的变化

贾 楠 尹勇刚 李敏敏 刘长江 韩 斌 孙 艳 赵胜建 郭紫娟

(河北省农林科学院 昌黎果树研究所，河北 昌黎 066600)

果实质地是一个综合的果实性状，对果实口感有很大影响，是苹果[1]、桃[2]、梨[3]、香蕉[4]、蓝莓[5]、杨梅[6]、芒果[7]、草莓[8]和葡萄[9]等果实品质的重要评价指标，同时对果实运输、加工、贮藏保鲜和货架期的长短也有显著影响。葡萄果实属于典型的浆果，果实质地具有皮薄多汁和果肉柔软的特点[10]，在采后运输和贮藏期间更易出现挤压变形、失水萎蔫,甚至腐烂变质现象[11]。因此，亟需研究葡萄果实质地发生变化的机制，为葡萄质地改良育种奠定基础。

果实质地主要由细胞间结合力、细胞壁物质的机械强度以及细胞大小和形状等因素决定[12]。在苹果上研究发现，水溶性果胶、离子型果胶及纤维素含量差异是苹果质地差异的关键因子[13],果肉细胞显微结构及一些细胞壁相关代谢酶的差异与苹果质地变化密切相关[14]。在蓝莓上研究发现，果实硬度的降低伴随着水溶性果胶的增加及纤维素和半纤维素的减少[15-16]。此外，果实质地也受基因调控。果实质地发育的差异是多种基因协同作用的结果，其中多聚半乳糖醛酸酶(PG)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和葡聚糖内糖基转移酶(XET)基因等在苹果质地发育中起关键作用[17]。目前，关于果实质地变化的研究多集中在生理代谢[13-16,18]和基因调控[17,19]方面，且在苹果和蓝莓上研究较多。从结构决定功能角度分析，果实结构的变化是影响果实质地的细胞学基础，而目前关于葡萄果实显微结构与质地变化关系的研究相对欠缺。本研究利用质地多面分析法(TPA)和石蜡切片法，对‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中的质地参数和果实细胞的解剖结构进行了研究，并对果实基本性状进行了测定，以期阐明葡萄果实成熟中质地参数与果实显微结构的变化及两者的相关关系，为解析葡萄果实质地的细胞学研究奠定基础，进而为葡萄果实质地改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究在河北省农林科学院昌黎果树研究所施各庄基地(39°47′ N，119°20′ E)进行。年平均气温12.24 ℃，太阳日平均有效辐射165 μmol/(m2·s)，降水总量601.8 mm。试验于2019年进行，以5年生葡萄品种‘玫瑰香’为试验材料，于幼果期(S1)、转色期(S2)、成熟前2周(S3)和成熟期(S4)进行果实采样。试验区为露地棚架栽培，株行距0.7 m×4.0 m，正常水肥管理。土壤为砂壤土，0～60 cm土壤的pH为5.88。土壤中有机质的质量分数为1.79%，氮的质量分数为0.15%，磷的质量分数为1.28 mg/kg,钾的质量分数为1.98 mg/kg。土壤排水灌溉条件良好。

1.2 试验方法

1.2.1试验设计

试验采用完全随机区组设计，3次重复，每个重复选取5棵树。每棵葡萄树随机采3穗果，每个果穗从上中下共采集10粒果，进行果实品质、质地和解剖结构的测定，每个指标测定3次生物学重复。

1.2.2葡萄果实基本品质测定

单果重采用电子天平测定，单果重=30粒总重量/30。每次生物学重复随机选取10粒果实进行果实纵横径、可溶性固形物和可滴定酸含量的测定。其中果实纵横径采用游标卡尺进行测定，可溶性固形物含量采用糖度计(PAL-1,日本)测定，可滴定酸含量采用果实酸度计测定(GMK-835F,韩国)。

1.2.3质地多面分析法测定葡萄果实质地

每次生物学重复将随机选取20粒果实进行质地测定。葡萄果实样品置于质地分析仪(CT3,美国)平板上，采用TA25/1000柱头进行测定。参数设置如下：预压速度、下压速度和压后上行速度均为2.0 mm/s，2次压缩间停顿5.0 s，试样受压形变为25%，触发力为5 g。由质地曲线得到果实硬度、内聚性、弹性和咀嚼性4个参数，用于后续分析。其中，硬度为第1次压缩时的最大峰值，内聚性为2次压缩面积之比，弹性为第1次循环目标形变至第2次循环触发点间的位移，咀嚼性=硬度×内聚性×弹性。

1.2.4葡萄果实细胞解剖结构的观察

每次生物学重复随机选取20粒进行果实结构的观察。果实结构的观察采用石蜡切片法[20-21]，从果实赤道处垂直果皮切取大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的方块(包含果皮和果肉)，立即放入甲醛-乙酸-乙醇(FAA)固定液,抽气后固定待用；然后经过酒精梯度脱水，石蜡包埋，切片(厚度为10 μm),番红-固绿染色，中性树胶封片，用显微镜(Olympus BX51,日本)观察果实细胞结构并拍照。用SPOT软件测量果实细胞形态学参数(表皮和亚表皮厚度、细胞面积、周长、纵径和横径)。

表皮和亚表皮细胞排列方式为较疏松、紧密、致密、较致密和非常致密，果肉细胞排列方式为不均匀松散和均匀紧密。

1.3 统计分析

使用Excel软件和SPSS 20.0软件进行数据的分析和处理，利用Duncan’s检验差异显著性(P=0.05)，并用Excel软件制图。

2 结果与分析

2.1 ‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中果实品质的变化

随着‘玫瑰香’果实的成熟，果实的单果重(图1(a))和可溶性固形物含量均显著增加(图1(b))，可滴定酸含量显著降低(图1(b))，且三者均在幼果期到转色期变化幅度最大。从幼果期到转色期果实的纵径和横径显著增加，纵横比显著下降，而从成熟前两周到成熟期果实的纵径、横径及纵横比变化不显著(图1(c))。综合来看，‘玫瑰香’果实在成熟过程中，以转色期为临界点，幼果期到转色期果实品质发生了显著变化，转色后，变化趋势变缓；此外果实在增长的同时，果粒变圆，口感变甜。

2.2 ‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中果实质地的变化

‘玫瑰香’果实成熟过程中，果实硬度呈下降趋势，幼果期到转色期，果实硬度急剧下降，转色后至成熟期果实硬度差异不显著(图2(a))。这表明，在果实成熟过程中，果实在转色期迅速软化，而后趋于平缓。内聚性与硬度变化规律相反呈上升趋势，幼果期到转色期，果实内聚性显著提高(图2(b))。内聚性为咀嚼果实时，果实抵抗受损，使果实保持完整的性质，可反映果实细胞间结合力的大小，这表明果实细胞间结合力在幼果期到转色期迅速上升；而转色期至成熟期果实内聚性无显著变化(图2(b))。弹性的变化趋势与内聚性相似，随着果实成熟，弹性呈上升趋势，在幼果期到转色期增幅最大(图2(c))，而在成熟前2周到成熟期弹性无明显差异。弹性为果实经过第一次压缩后能够再恢复的程度，这表明在幼果期到转色期果实受压后恢复能力明显增强。咀嚼性在果实成熟过程中整体呈下降趋势，在转色期达到最低，而后上升，成熟时又降低(图2(d))。这是由于咀嚼性为硬度、内聚性和弹性的乘积，转色期果实硬度急剧降低占据主导，使得咀嚼性在转色期最低；在转色后，弹性增加并占主导地位，使得咀嚼性升高；而后，硬度降低又占主导，使得成熟时果实咀嚼性降低。

S1、S2、S3和S4分别表示幼果期、转色期、成熟前两周和成熟期。图中不同时期的不同字母表示数据存在显著性差异(P=0.05)；下同。TSS：可溶性固形物；TA：可滴定酸。S1,S2,S3 and S4 represent young fruit stage,veraison,two weeks before mature stage,and mature stage,respectively.Different letters in different periods in the figure mean significant differences at 0.05 level;The same below.TSS,soluble solids;TA,titratable acid.图1 ‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中果实单果重(a)、糖酸质量分数(b)和果实纵横径(c)的变化Fig.1 The changes of berry weight (a),the mass fraction of TSS and TA (b),and diameter of fruit (c)of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

图2 ‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中果实硬度(a)、内聚性(b)、弹性(c)和咀嚼性(d)的变化Fig.2 The changes of berry firmness (a),cohesiveness (b),springiness (c)and chewiness (d)of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

2.3 ‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中果皮细胞结构的变化

从果皮结构(表皮和亚表皮)看，‘玫瑰香’果实的表皮和亚表皮在幼果期细胞排列非常致密，细胞较小，在转色期细胞排列紧密，细胞变大，转色后细胞排列较为疏松，细胞较大(表1)。表皮细胞面积在果实成熟过程中显著增加，幼果期表皮细胞面积为138.80 μm2，而成熟期为263.09 μm2；亚表皮细胞面积与表皮细胞面积变化规律一致，由幼果期的1 507.67 μm2增长到成熟期的2 160.31 μm2。表皮细胞层数在果实成熟过程中未发生变化，为2～3层；而表皮细胞厚度随着果实成熟，显著降低，在幼果期表皮细胞厚度为28.33 μm，而成熟期为22.94 μm；其中从幼果期到转色期下降幅度最大，达到了16.01%(表1)。亚表皮细胞层数在幼果期为9～10层，而从转色期开始直至成熟减少为6～7层；亚表皮细胞厚度从幼果期到转色期显著减少，由173.15 μm减少为142.65 μm，而转色期至成熟期无明显变化。以上表明，‘玫瑰香’果实在成熟过程中，由于表皮细胞和亚表皮细胞厚度的下降，亚表皮层数的减少，使得果皮变薄。

表1 ‘玫瑰香’葡萄成熟过程中果皮细胞形态的变化Table 1 Changes of pericarp cell morphological parameters of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

2.4 ‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中果肉细胞结构的变化

果肉细胞在幼果期排列均匀紧密，细胞较小；从转色期至成熟期，细胞排列不均匀松散，细胞较大(表2)。果肉细胞的面积在果实成熟过程中显著增加，由幼果期的17 559.96 μm2增加至成熟期的29 091.42 μm2；其中，幼果期到转色期果肉细胞面积增长幅度最大，可达41.26%(表2)。果肉细胞周长和纵径与果肉细胞面积变化规律一致，随着果实的成熟，也显著增加，且在幼果期至转色期涨幅最多，分别增长了23.38%和36.16%。果肉细胞横径随着果实成熟也显著增加，由幼果期的134.62 μm增加至成熟期的195.27 μm；在转色期到成熟前两周，果肉细胞横径增长最快，增长了16.71%。果肉细胞纵横比在幼果期最小，比值为1.15，细胞近圆形；在转色期最大，比值为1.46，细胞近长圆形；这与幼果期到转色期果肉细胞纵径增加幅度高于横径有关。

表2 ‘玫瑰香’葡萄成熟过程中果肉细胞形态的变化Table 2 Changes of flesh cell morphological parameters of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

2.5 ‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中质地参数与果实细胞形态学参数的相关性分析

果实硬度和咀嚼性均与表皮细胞厚度和亚表皮细胞厚度呈极显著正相关(硬度的相关系数为 0.947 和0.907，咀嚼性的相关系数为0.864和0.865)；与表皮细胞面积、亚表皮细胞面积及果肉细胞形态指标呈极显著负相关(硬度的相关系数为-0.938～-0.554，咀嚼性的相关系数为-0.881～-0.524)(表3)。果实内聚性和弹性均与表皮细胞厚度和亚表皮细胞厚度呈极显著负相关(内聚性的相关系数为-0.934和-0.902，弹性的相关系数为-0.926和-0.814)，与表皮细胞面积、亚表皮细胞面积及果肉细胞形态指标呈显著正相关(内聚性的相关系数为0.558～0.914，弹性的相关系数为0.224～0.919)。综合来看，表皮细胞厚度和果肉细胞纵径与果实质地参数相关系数相对比较高。综上说明，‘玫瑰香’果实成熟过程果实解剖结构对果实质地有显著的影响，即随着果实成熟，果实硬度降低，口感变软，果皮变薄，果皮细胞和果肉细胞增大。

表3 ‘玫瑰香’葡萄成熟过程中质地与果实细胞形态的相关性Table 3 Correlations between berry cell morphological parameters and texture parameters of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

3 讨论与结论

果实质地是果实品质性状的重要影响因子之一。本研究发现，‘玫瑰香’果实成熟过程中，果实硬度和咀嚼性呈下降趋势，而果实内聚性和弹性呈上升趋势，表明‘玫瑰香’果实成熟过程中，果实质地发生了显著变化，这与前人在苹果[14]和梨[22]上研究结果一致。此外,本研究发现,‘玫瑰香’果实质地发生变化转折点为转色期，由幼果期到转色期果实质地变化剧烈，转色期后变化趋于平缓。可能有以下原因：其一，葡萄果实转色期伴随着果实内部一系列生理生化指标的改变，包括可溶性固形物的急剧积累[23-24]、有机酸的分解[25]和总酚物质的减少[26]等，这些变化与细胞溶质势和压力势密切相关[27-28]，直接影响细胞水势。因此，葡萄果实转色期的质地变化较大，可能与该时期的果实内部物质代谢导致细胞水势改变相关，需要进一步验证。其二，‘玫瑰香’葡萄果实成熟过程中，果实解剖结构发生了很大变化。果皮细胞和果肉细胞排列变疏松，细胞面积变大，果皮厚度减少，且在转色期变化幅度最大。进一步相关性分析表明，果实硬度和咀嚼性与果皮(表皮和亚表皮)厚度呈极显著正相关，与果皮细胞面积及果肉细胞面积、周长、纵径、横径和纵横比呈极显著负相关；果实内聚性和弹性与果皮厚度呈极显著负相关，与果皮细胞面积及果肉细胞面积、周长、纵径、横径和纵横比呈显著正相关。其中表皮细胞厚度和果肉细胞纵径与果实硬度、咀嚼性、内聚性和弹性相关性较高，相关系数的绝对值在0.864以上。这说明果皮厚度、果肉细胞形状和大小对果实质地有显著影响。

本研究表明,随着‘玫瑰香’果实质地变软，表皮细胞和亚表皮细胞厚度减少,亚表皮细胞层数降低，细胞排列变疏松，细胞面积变大。在西瓜[29]和苹果[30]上发现果皮细胞较厚且果皮细胞排列紧密的品种的果实耐挤压特性较好，这与本研究结果相似。进一步相关分析表明，果实质地指标与果皮细胞参数呈极显著相关，且果皮(表皮和亚表皮)细胞与果实质地的相关性整体上高于果皮细胞面积与果实质地相关性，这说明相比于果皮细胞面积，果皮厚度对‘玫瑰香’果实质地的影响较大。此外，在‘玫瑰香’果实成熟过程中，果实质地变软，果肉细胞变化与果皮细胞变化一致，排列变疏松，细胞变大，这与前人在苹果[14]和桃[31]上研究结果一致。相关性分析结果表明，果实质地指标与果肉细胞参数呈极显著相关，且与果肉细胞面积和纵径相关性较高。在甜瓜上发现果肉细胞形态学参数与质地参数相关，其中只有部分果肉细胞形态学参数与质地参数达到显著或极显著水平[32]，这与本研究结果不一致。可能与2次实验取样时间差异有关，本实验取样至成熟期结束，而上述试验取样至衰老期，在此基础上进行分析可能会对结果有一定影响。

综上所述，‘玫瑰香’果实成熟过程中，果实质地与果实解剖结构均发生显著变化，果实质地由硬变软，果皮变薄，果皮和果肉细胞变大，排列变疏松。进一步分析表明，果实质地与果实细胞形态显著相关，其中果皮厚度及果肉细胞横径和面积指标相关性较好。因此，在今后葡萄质地育种中，可结合果皮和果肉的细胞解剖形态对果实质地进行综合判断。此外，除了果实细胞的解剖形态以外，细胞的超微结构也可能与葡萄果实质地有关。在苹果上通过激光共聚焦显微镜对果肉细胞结构进行观察，结果表明细胞间隙与果实硬度呈极显著负相关[33]。通过扫描电镜观察不同质地的苹果果实断裂面，发现断裂面差异明显[34]。本试验采用的光学显微镜无法对细胞超微结构进行精准测定和评价，因此在今后实验中，可采用高分辨率的显微镜对果实细胞超微结构进行观察，为解析果实质地提供理论依据，以期加快质地育种进程。