黄淮麦区71个小麦品种的赤霉病抗性与基因型分析

胡文静，高德荣，江 伟，廖 森，马红勃，张晓祥

(1.江苏里下河地区农业科学研究所/农业农村部长江中下游小麦生物学与遗传育种重点实验室，江苏扬州 225007；2.扬州大学/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心，江苏扬州 225009； 3.长江大学农学院，湖北荆州434023；4.江苏徐淮地区徐州农科所，江苏徐州221131 )

小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是由禾谷镰孢菌(FusariumgraminearumSchw.)等多种镰刀菌引起的世界性病害，常发生在温暖湿润地区。小麦开花期遇到连续阴雨且气温在15℃以上时，赤霉菌侵染小麦穗部并迅速扩展，在籽粒灌浆成熟过程中不断繁殖，并产生和累积多种毒素，导致小麦产量受损、品质降低，甚至造成食品安全问题，危害人畜健康[1]。因此，选育和推广抗赤霉病小麦品种是解决赤霉病危害最安全、经济和有效的途径[2]。长江中下游麦区是我国小麦赤霉病的重发区，选育抗赤霉病的小麦品种一直是该麦区重要育种目标，自上世纪80年代以来，该麦区育种家相继选育出一批赤霉病抗性较好的小麦品种，如扬麦4号、扬麦5号、扬麦158、苏麦3号等，此外，一些农家品种，如望水白、黄方柱、白三月黄等，也都呈现出稳定的赤霉病抗性，这些品种已被国内外小麦育种单位作为赤霉病抗源使用[2-4]。由于黄淮麦区历史上缺少赤霉病的诱发环境，育种家对抗病品种的关注较晚，造成一旦气候变化和耕作制度改变，该麦区的赤霉病危害迅速蔓延和加重[5-6]。因此，发掘和利用小麦抗赤霉病种质资源，培育赤霉病抗性达到中感及以上水平的小麦品种已经成为黄淮麦区的主要育种目标之一[7]。

培育抗赤霉病小麦品种离不开抗赤霉病基因的利用。近年来，国内外对小麦抗赤霉病基因的研究进展迅速，为小麦赤霉病抗性遗传改良奠定了理论基础。目前共定位到250余个赤霉病抗性基因/QTL，分布在小麦21条染色体上[1]，但明确的抗赤霉病基因只有7个，即Fhb1～Fhb7，其中Fhb1、Fhb2、Fhb3、Fhb6和Fhb7是赤霉病抗扩展类型，Fhb4和Fhb5是赤霉病抗侵染类型，Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5来源于普通小麦，Fhb3、Fhb6和Fhb7来源于外缘种质[8-12]。目前已知效应值较大的抗赤霉病QTL有QFhs.crc-2DL、Fhb7AC和QFhb.cau-7DL[13-15]。苏麦3号等长江中下游麦区的抗赤霉病品种虽然赤霉病抗性稳定，但这些品种与我国黄淮麦区的小麦品种遗传背景差异太大，在株型、生育期等方面具有显著差异，利用它们改良该麦区品种的赤霉病抗性需要的育种周期很长，甚至最终会因为抗性基因丢失导致抗赤霉病育种失败。迄今在黄淮麦区罕见选育出赤霉病抗性较好的品种[16]，因此从该区域内筛选优良赤霉病抗源用于小麦遗传改良显得尤为重要。前人在黄淮麦区已开展了一些筛选抗赤霉病小麦品种(系)的研究[17]，如张 煜等[6]采用土表接种结合单花滴注的方法对黄淮南部762个小麦品种(系)的赤霉病抗性进行鉴定，仅筛选出10个稳定的中抗赤霉病小麦品种(系)。张 彬等[18]对黄淮南片65个主栽小麦品种进行了赤霉病抗性鉴定，发现黄淮南片主栽小麦品种的赤霉病抗性普遍较差。本研究以71个黄淮麦区小麦品种(系)为材料，连续两年采用单花滴注接种的方法，对供试品种(系)进行赤霉病抗性鉴定，并利用与Fhb1[19-20]、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因[6]和QFhs.crc-2DL位点[13]紧密连锁的分子标记对供试材料进行检测及分析，以期为该麦区小麦抗赤霉病育种提供遗传资源与信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

71份供试品种(系)分别来自江苏、安徽、河南、山东、陕西、河北和北京，分别以苏麦3号、郑麦9023、淮麦22和济麦22为赤霉病抗病(Resistant，简称R级)、中抗(Moderately resistant，简称MR级)、中感(Moderately susceptible，简称MS级)和感病(Susceptible，简称S级)对照品种。

禾谷镰孢菌菌株(F0301、F0609、F0980和F1312)由江苏省农业科学院植物保护研究所陈怀谷研究员惠赠。

1.2 试验设计

试验于2016―2017和2017―2018年度2个小麦生长季在江苏里下河地区农业科学研究所扬州湾头试验基地赤霉病鉴定圃内进行。播种日期均为每年的10月25日。每品种种植2行，行长1.5 m，行距25 cm，每行均匀播种30粒种子，2次重复。土质为沙壤土，前茬为水稻，肥力中等，田间管理如施肥、除草、灌溉和虫害防治同常规育种田。

1.3 赤霉病抗性鉴定与评价

参照Yu等[21]的方法制备赤霉菌孢子悬浮液(1×105～ 5×105个·mL-1)。

接种方法：采用单花滴注法接种，于小麦开花初期，用注射器吸取10 μL孢子液注入麦穗自顶部小穗开始自上而下第6个小穗的任意一个小花中，每个品种接种20个穗子，2次重复。接种后采用人工弥雾保湿(每半小时弥雾5 min)21 d。

抗性评价方法：接种21 d后调查接种穗的病小穗数，计算病小穗率。病小穗率=发病小穗数/总小穗数×100%。病情严重度调查和记载标准按照《中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2954-2016：小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》[22]和张晓军等[23]的方法进行，严重度分级标准：接种小穗无可见发病症状，0级；仅接种小穗发病，或相邻的个别小穗发病，但病斑不扩展到穗轴，1级；穗轴发病，发病小穗占总小穗数的1/4以下，2级；穗轴发病，发病小穗占总小穗数的 1/4～1/2，3级；穗轴发病，发病小穗占总小穗数的1/2以上，4级。每年调查2次各病穗的病情严重度，再根据连续2年的平均严重度分级，将供试品种分为抗病(R级，0<平均严重度<2.0)、中抗(MR级，2.0≤平均严重度<3.0)、中感(MS级，3.0≤平均严重度<3.5)和感病(S级，平均严重度≥3.5)四个等级。

1.4 赤霉病抗性基因(QTL)的分子检测

每品种(系)选取10粒种子，室温下发芽，取嫩叶放入液氮中速冻，采用CTAB法[24]提取基因组DNA。采用与Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhb.crc-2DL位点连锁的标记(表1)对供试材料进行检测，检测所用的阴性对照品种均为郑麦9023，其中Fhb1参考Rasheed等[25]的检测方法，以苏麦3号为阳性对照，检测结果与阳性对照品种一致的，说明该品种(系)可能携带Fhb1基因。Fhb2、Fhb4和Fhb5基因参考张 煜等[6]的检测方法，均以望水白为阳性对照。QFhb.crc-2DL位点的检测以扬麦158为阳性对照，PCR反应体系为10 μL，包含2×Taq MasterMix(P114-03，中国南京诺唯赞生物科技有限公司)5.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.1 μL，DNA模板(50 ng·μL-1)1.0 μL，ddH2O 3.8 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhb.crc-2DL位点的两侧连锁标记与阳性对照品种检测结果一致，说明该品种(系)可能携带有该抗性基因/QTL。

表1 赤霉病抗性基因/QTL相应分子标记信息

1.5 数据统计分析

利用Microsoft Excel 2016对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 供试品种(系)的赤霉病抗性

根据2016-2017和2017-2018两年度的赤霉病抗性鉴定结果，共筛选到赤霉病抗性达中抗的品种(系)5个，占供试品种总数的7.0%，分别为皖麦32(安徽)、皖麦31(安徽)、新乡289(河南)、西农511(陕西)和徐麦DH9(江苏)，平均病小穗率为19.3%～26.3%，平均严重度为2.0～2.5；赤霉病抗性达中感的品种(系)17个，占供试品种总数的24.0%，11个来自江苏，4个来自河南，1个来自安徽，1个来自山东，平均病小穗率为28.9%～48.5%，平均严重度为3.0～3.4；感赤霉病的品种(系)有49个，占供试品种总数的 69.0%，10个来自江苏，24个来自河南，10个来自山东，2个来自安徽，其他3个分别来自陕西、北京、河北，平均病小穗率为48.6%～ 78.8%，平均严重度为3.5～4.0。没有鉴定到赤霉病抗性达“抗”的品种(系)(表2)。

表2 71个小麦品种(系)的抗赤霉病鉴定结果

(续表2 Continued table 2)

2.2 赤霉病抗性基因/QTL的分子标记检测结果

利用与Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhs.crc-2DL位点紧密连锁的分子标记对供试品种(系)进行基因型分析，结果(表3)显示，徐麦DH9和淮麦40可能同时携带Fhb1基因和QFhs.crc-2DL位点，太麦198可能仅携带Fhb4基因，明麦16和皖麦32可能仅携带QFhs.crc-2DL位点。其他品种(系)未检测到所检测基因/QTL。

表3 赤霉病抗性基因/QTL的分子标记检测结果

3 讨 论

3.1 抗赤霉病种质资源筛选

单花滴注接种结合弥雾保湿是鉴定小麦赤霉病抗性最有效的方法。除对照品种苏麦3号外，本试验未鉴定到赤霉病抗性水平达到“抗”的品种(系)，说明黄淮麦区匮乏抗赤霉病的品种，这与张 煜等[6]和张 彬等[18]的研究结果一致。本研究发现，西农511、徐麦DH9、皖麦32等22个品种(系)对赤霉病的抗性达到中抗或中感水平，说明这22个品种(系)赤霉病发病较轻，在赤霉病发病年份结合药剂防治可在一定程度上控制病害的发生。经分析发现，上述22个对赤霉病表现为中抗或中感的小麦品种(系)大多来自或者适宜种植在江苏、安徽的北部和黄淮南部。2010年以来，随着气候的变化，小麦赤霉病在上述地区已由偶发性病害转变为常发性病害，该麦区的育种家们相继把培育中感及以上水平的小麦品种纳入育种目标，因此上述抗性较好的品种(系)无疑是育种家根据育种目标不断选择的结果，这些品种(系)的株高、穗数等农艺性状与当地的生态环境相适应，相较于苏麦3号、望水白等长江流域的抗源，这些品种(系)更适宜用于该麦区抗赤霉病小麦品种的遗传改良。

3.2 抗赤霉病基因/QTL分析

Fhb1基因是目前国内外唯一公认的抗赤霉病主效基因[26]，Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhs.crc-2DL位点是目前已报道的赤霉病抗性效应值较大且稳定的基因/QTL。本研究利用与这些基因/QTL紧密连锁的分子标记对供试品种(系)进行检测，发现大多数黄淮麦区小麦品种(系)不携带这些基因/QTL，原因可能是这些基因/QTL的来源是长江中下游麦区的地方品种和改良品种[20,27]，说明来源于长江中下游麦区的抗赤霉病品种或者抗性基因可能还未在黄淮麦区的抗赤霉病育种中广泛实践。本研究抗赤霉病表型鉴定是在长江中下游地区扬州的弥雾保湿圃内进行，小麦开花至灌浆时期满足高温高湿的赤霉病诱发条件，因此，赤霉病抗性鉴定表现为中感及以上水平的品种(系)可以被认定为赤霉病发病较轻、抗性较好的种质资源。抗赤霉病基因/QTL紧密连锁标记检测结果显示，国内外公认的赤霉病抗性最好的苏麦3号同时携有Fhb1、Fhb2基因和QFhs.crc-2DL位点，说明抗病基因/位点的聚合效应显著。本研究还发现，可能同时携有Fhb1基因和QFhs.crc-2DL位点的品种有徐麦DH9和淮麦40，赤霉病抗性分别达到中抗和中感，系谱分析表明，徐麦DH9的赤霉病抗性来源于H35，而淮麦40来自太谷核不育轮回选择，其抗病基因的来源尚不清楚；皖麦32和明麦16可能仅携带QFhs.crc-2DL抗性位点，对赤霉病分别表现为中抗和中感，其中皖麦32的赤霉病抗性来自扬麦158，而扬麦158携有多个抗赤霉病位点[4]；明麦16的亲本为徐3-01和矮抗58，但其抗病基因的来源尚不清楚。上述结果显示，相同的抗病基因在不同的品种中表现的效应不同，说明赤霉病抗性基因的表达与品种本身的遗传背景等有关[6]，即使携带抗赤霉病主效基因Fhb1，该品种也不一定抗赤霉病，因此在抗赤霉病育种中不是单纯的导入某1个或者2个抗病基因/QTL就能显著提高该品种的赤霉病抗性，要同时注重遗传背景和抗性基因/QTL的相互选择。太麦198可能携带Fhb4，抗性达到中感水平，其亲本为良星619和山农17，但其抗病基因的来源尚不清楚。其他中抗或中感赤霉病的品种(系)中均未检测到Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhs.crc-2DL位点，推测它们可能携带其他抗赤霉病基因/QTL，小麦抗赤霉病基因/QTL的挖掘和机理机制的研究还有待进一步深入进行。小麦抗赤霉病属于复杂的多基因控制性状，本研究中仅有6个品种(系)携带1～3个所检测抗病基因/QTL，因此无法用统计学方法分析基因/QTL对小麦赤霉病抗性的单位点效应或者聚合效应，下一步拟增加供试材料，选择黄淮麦区近几年育成的其他主栽品种继续进行研究，深入解析遗传背景和抗性基因的相互影响。

4 结 论

本研究于2016-2017和2017-2018两年度分别对71个黄淮麦区的小麦品种(系)采用单花滴注接种的方法进行赤霉病抗扩展性鉴定，没有发掘到高抗赤霉病的品种(系)，西农511、徐麦DH9、皖麦32、皖麦31、新乡289、淮麦30、淮麦40、连麦2号、淮麦21、淮麦44、淮麦33、淮麦38、徐农029、明麦16、江麦23、淮麦36、皖麦33、偃展4110、新乡197、新乡280、郑1860和太麦198对赤霉病的抗性达到中抗或中感水平。徐麦DH9和淮麦40可能同时携带Fhb1基因和QFhs.crc-2DL位点；明麦16、皖麦32可能仅携带QFhs.crc-2DL位点；太麦198可能仅携带Fhb4。研究结果可为黄淮麦区的小麦抗赤霉病育种提供遗传资源与信息。

致谢：感谢中国农业科学院作物科学研究所夏先春研究员和董亚超技术员在KASP基因分型方面提供的技术支持。