不同种植模式对佛手山药土壤养分和微生物群落的影响

刘东海，乔 艳，李双来，张 智，李 菲，徐 为，胡 诚

（1.湖北省农业科学院植保土肥研究所，武汉 430064；2.湖北美天生物科技股份有限公司，湖北 武穴 435400）

武穴市是全国最大的佛手山药生产基地［1］，播种面积2 000 hm2。佛手山药因其品种独特，品质优良，风味独特，味道鲜美，营养丰富，2012 年被湖北省农业厅授予“首届湖北名优蔬菜”［2］。长期连续种植山药会导致土壤中微生物组成和数量发生变化［3，4］，破坏土壤耕层微生物种群结构［5］，并抑制土壤酶活性，加重根结线虫的危害［6］，甚至诱发严重的土传病害［7］，从而影响山药生长发育和产量［8］。宋佳承［9］指出马铃薯-玉米轮作明显提高了马铃薯根际土壤中细菌和真菌多样性，改变了细菌和真菌的群落结构，对调控马铃薯连作障碍效果较好。苏燕等［10］指出水旱轮作模式可提高马铃薯根际土壤的细菌群落多样性，重点预防马铃薯发生细菌性病害。范琳娟等［11］增加山药种植间隔期，可改变土壤线虫群落结构，大幅降低植物寄生线虫丰度，增加土壤生态系统健康程度。

研究者采用微生物培养技术开展了山药连作对土壤主要微生物类群的影响，仅限于对土壤中极少数部分（0.1%～1.0%）可培养的微生物类群的研究。高通量测序技术可全面、准确获得微生物群落结构信息的特点，在细菌和真菌方面应用较多，但是线虫研究停留在传统的形态学方法。本研究采用高通量测序（细菌16S rDNA、真菌18S rDNA 和线虫NF1-F/18Sr2b-R）技术对经过3 年连作和水稻山药轮作的山药土壤中的细菌、真菌和线虫多样性展开研究，结合土壤理化性质以及产量数据，分析不同种植模式下土壤微生物的变化情况，为减轻山药连作障碍，采用更好的轮作模式提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验地点位于湖北省武穴市余川镇大祝村，土壤类型为沙质壤土，品种均为本地佛手山药品种，试验地设置为2 个处理。处理1的种植模式是3 年水稻山药轮作（SY），处理2 是3 年山药连作（LZ）。土壤耕层（0～30 cm）进行多点取样，每个处理按“S”形选取5 个样点，土样充分混合均匀，装入已消毒的自封袋中，放入冰盒中带回。每个混合土样分为两部分，一部分用于化学指标测试，另一部分放置于-80 ℃冰箱保存，用于DNA 提取和高通量测序。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 土壤理化性状测定 碱解氮用碱解扩散法，速效磷用紫外可见分光光度法，速效钾用火焰光度法，有机质用重铬酸钾法，土壤pH 采用1.0∶2.5的水土比、复合电极测定；植株样品测定全氮、全磷、全钾含量。样品用H2SO4-H2O2消煮，全氮用凯氏定氮法，全磷用钼锑抗比色法，全钾用火焰光度法进行测定。粗蛋白质的测定采用凯式定氮法，将所测得值乘以系数6.25 即为其粗蛋白质含量。以上测定方法均参考文献［12］。

1.2.2 细菌和真菌扩增测序 采用EZNA Soil NDA Kit（Omega Bio-tek 公司）提取土壤总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。对16S rDNA 基因的V3-V4 高变区片段进行PCR 扩增，引物序 列为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。对18S rDNA 基因的V3-V4 高变区片段进行PCR 扩增引物序列为SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和81196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）。扩增条件为95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 个循环；72 ℃延伸5 min。每个样本3 个重复，将同一样本的PCR 产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒（AXYGEN Biosciences 公司）切胶回收PCR 产物，Tris_HCl 洗脱；2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR 产物用QuantiFluor-ST 蓝色荧光定量系统（Promega 公司）进行检测定量，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。在上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina Miseq PE300、PE 250平台分别进行细菌和真菌的测序。

1.2.3 线虫群落的扩增测序

1）使用引物NF1-F/18Sr2b-R［13］对线虫18S rDNA V4区进行扩增。PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL 反应体系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Forward Primer（5 μmol/L）0.8 μL，Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，灭菌PCR 水补足至20 μL。

2）线虫（NF1FF/18Sr2bR）PCR 扩增条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 次循；72 ℃延伸10 min。扩增之后，PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳，使用AxyPrep DNA 凝胶提取试剂盒进行纯化，并使用QuantiFluor-ST（Promega 公司）对回收产物进行检测定量。根据Illumina MiSeq 平台（Illumina 公司）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 300 文库。利用Illumina公司的Miseq PE300 平台进行双端测序。

1.3 数据统计及分析

生物信息分析使用Trimmomatic 软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH 软件进行拼接。使用UPARSE 软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类。数据整理采用Microsoft Excel 2007。

2 结果与分析

2.1 土壤基础化学性质和产量

与轮作比较，连作导致佛手山药的产量降低了41.88%；连作对山药块茎的粗蛋白、全氮、全磷和全钾养分含量影响不显著（表1）。

表1 山药块茎氮磷钾含量及产量

与轮作比较，连作导致土壤中碱解氮、有效磷、速效钾和全氮分别提高了36.06%、10.41%、80.41%和12.77%。但是土壤中全磷、全钾和pH 变化不显著（表2）。

表2 土壤养分和pH 情况

2.2 土壤细菌、真菌和线虫群落结构特征

2.2.1 土壤微生物α 多样性 与轮作比较，连作导致土壤中细菌、真菌和线虫的序列数分别降低了6.96%、12.78%和36.74%。连作导致土壤细菌、真菌和和线虫丰富度指数（ChaoI）分别降低了18.64%、6.26%和16.22%，多样性指数（ShannonI）则分别降低了13.46%、10.38%和10.55%。连作降低了土壤微生物群落的多样性（表3）。

表3 土壤细菌、真菌和线虫多样性

2.2.2 土壤细菌群落组成绿弯菌门、放线菌门、变形菌门、厚壁菌门和酸杆菌门是土壤优势菌群（相对丰度＞5%），共占到群落组成的86.08%～92.63%。轮作处理中细菌丰度排序是放线菌门（26.37%）＞变形菌门（20.20%）＞绿弯菌门（18.34%）＞厚壁菌门（13.01%）＞酸杆菌门（8.16%）＞芽单胞菌门＞拟杆菌门＞腐霉菌门。连作处理中细菌丰度排序是绿弯菌门（35.41%）＞放线菌门（25.48%）＞变形菌门（10.64%）＞厚壁菌门（10.44%）＞酸杆菌门（10.26%）＞芽单胞菌门＞腐霉菌门＞拟杆菌门。与轮作比较，连作导致绿弯菌门和酸杆菌门分别提高了93.08%和25.74%，但变形菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门和拟杆菌分别降低了47.33%、19.75%、41.35% 和67.19%（图1A）。

细菌属水平上，连作处理绿弯菌门中的norank_f__JG30-KF-AS9 属占比最高（25.88%）。与轮作比较，连作显著提高了绿弯菌门中norank_f__JG30-KF-AS9（3.13 倍）的丰度。连作导致变形菌门中的Chujaibacter 和鞘脂单胞菌属、放线菌门中的节杆菌属和地杆菌属、厚壁菌门的芽孢杆菌属和子囊菌门中的假丝酵母菌属，分别降低了63.47%、65.86%、73.42%、70.57%、29.69% 和23.25%。轮作处理中other（＜0.01的细菌种群），所占的比例54.39%，而连作导致other（＜0.01的细菌种群）降低了32.08%，说明连作减少了细菌中稀有物种的多样性（图1B）。

图1 细菌群落组成

2.2.3 土壤真菌群落组成 从门水平看出，不同处理下真菌群落的优势种群依次都是子囊菌门、担子菌门和毛霉菌门，三者占群落丰度的95%以上，在土壤真菌群落结构中占主导地位。与轮作比较，连作导致子囊菌门降低了6.89%，担子菌门和毛霉菌门分别提高了40.15%和100.28%（图2A）。

从属水平上看出，轮作处理中子囊菌门Plectosphaerella 丰度最高（34.63%），而连作处理中子囊菌门unclassified_o_Eurotiales 丰度最高（46.45%）。镰孢属Fusarium 在轮作和连作丰度分别是12.39%和11.76%，差异不大。与轮作比较，连作中unclassified_o__Eurotiales、Heterocephalacria 和缨霉属Thysanophora 分别显著提高了368.89%、269.16%和93.69%，然而Plectosphaerella 和孢霉属Arthrinium 分别降低了95.16%和64.60%（图2B）。

图2 真菌群落组成

2.2.4 土壤线虫群落组成 轮作和连作处理中线虫门水平的丰度分别是0.05%和1.88%。纲水平下，线虫色矛纲丰度分别是0.05%和1.33%。与轮作比较，连作土壤中线虫类群的丰度显著提高（图3）。

图3 线虫群落组成

3 小结与讨论

3.1 小结

连作降低了佛手山药的产量（41.88%）和土壤微生物群落多样性，富集了土壤速效养分。在山药连作和轮作下，土壤细菌、真菌群落和线虫群落组成结构出现较大差异。连作显著提高绿弯菌门丰度，使其成为主要的优势类群，同时降低了变形菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门和拟杆菌门丰度。连作和轮作处理中真菌优势种群都是子囊菌门和担子菌门。连作降低了子囊菌门丰度，提高了担子菌门和毛霉菌门丰度。连作土壤中线虫类群的丰度显著提高。

3.2 讨论

3.2.1 理化性质和产量 山药连作导致土壤速效养分的富集尤其是有效磷和速效钾，其中有效磷含量超过阈值106.2 mg/kg［14］，速效钾最高达到644.48 mg/kg，极大地增加了养分淋失的风险，这与农户习惯施肥有关。有研究指出有机肥、无机肥与微生物肥料的质量比例为250～300∶10∶1，有利于山药的生长，改善山药品质［15］。轮作显著提高了山药的产量，与宋佳承［9］指出轮作提高马铃薯产量的结论一致。

3.2.2 微生物多样性 轮作提高了土壤细菌和真菌多样性，与马铃薯-玉米轮作明显提高了马铃薯根际土壤中细菌和真菌多样性的结论一致［9］。连作降低土壤线虫多样性指数，与棉花连作10～15 年会发生土壤养分失衡，土壤线虫多样性降低的结论一致［16］。轮作的微生物多样性高于连作，可能是水旱轮作模式下，土壤环境厌氧及好氧条件交替，土壤中的碳、氮循环加速所导致［17，18］。

3.2.3 微生物群落组成 佛手山药土壤绿弯菌门、放线菌门、变形菌门、厚壁菌门和酸杆菌门是优势菌群，与淮山药根际土壤细菌在门水平上的主要优势菌群类似［19］。连作显著提高了绿弯菌门丰度，却降低了变形菌门的丰度；绿弯菌门可降解土壤纤维素等物质，参与土壤碳循环［20］。变形菌参与了必需矿物质营养的生物循环［21］，高比例的变形菌可能有助于改善土壤肥力，有助于植物生长［22］。连作改变细菌群落结构，进而可能间接影响土壤肥力。连作导致细菌属水平下丰度＜0.01的种群降低了32.08%，说明连作降低了细菌中稀有物种的多样性。

轮作和连作处理真菌群落的优势种群依次是子囊菌门、担子菌门和毛霉菌门，在土壤真菌群落结构中占主导地位。属水平上看出，轮作处理中Plectosphaerella 丰度最高（34.63%）；Plectosphaerella 种类存在不同的栖息地，地理分布广泛［23，24］，大多数物种是病原体，在生产中可造成巨大损失［25］。连作处理中unclassified_o_Eurotiales 丰度最高（46.45%），Eurotiales 跟苹果病害有关［26］。

土壤线虫是一种丰富而普遍存在的生物，在营养循环、分解、害虫和病原体种群调节等过程中发挥着重要作用［27，28］。耕作和施肥等土壤管理能够影响线虫群落多样性［29］。本研究表明，轮作提升了土壤线虫群落的多样性，降低了线虫的物种丰度。