PpPRR5 基因在不同光合速率梨品种中的表达分析

刘 政，安 琳，伍 涛，秦仲麒，杨 立，程寅胜

（1.湖北省农业科学院果树茶叶研究所/湖北省农业科技创新中心果树茶叶研究分中心，武汉 430064；2.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430072）

伴随昼夜和季节周期性交替，生物体进化出“生物钟”这种内在调节机制，使之适应可预测的日常环境变化，达到更好生长和发育的目的［1，2］。光是植物生物钟最主要的外界环境信号，植物通过各种光受体（如光敏色素、隐花色素等）感知光强/光质变化，并将信号转递给中央振荡器［3，4］。中央振荡器是植物生物钟的核心部分，它通过一系列连锁的转录-翻译反馈路径产生周期性调控信号，并将其传递给下游调控基因［5，6］。目前已有研究表明，植物通过生物钟机制产生与环境信号相适应的节律，最终通过输出途径调节光合作用，进而促进生物量积累。例如，生物钟能控制赤桉、菜豆和棉花的气孔导度呈现24 h 周期性节律变化，这种变化形式与昼夜光照强弱变化相适应，进而更有效地促进白天碳同化过程［7，8］。糖等光合作用产物是植物生物钟一种重要的代谢输出形式，而内源的糖信号又反过来调控生物钟基因的表达［9］。玉米杂种中，正是由于生物钟基因ZmCCA1瞬时结合活性发生改变，提高了光合作用碳固定过程相关基因表达水平，进而促进杂种表现出比双亲更高的产量［10］。

梨是中国重要的果树物种，其冠层结构决定了光环境，进而对光合作用产生影响。为了探索梨树不同冠层光环境对光合作用变化的影响，前期利用转录组和光合生理数据关联分析的方法，发现生物钟周期节律代谢途径显著富集与田间梨树净光合速率表型密切相关的基因模块，并发现梨生物钟基因PpPRR5是该模块的核心基因，然而该基因影响梨树光合作用的功能尚未阐明。在拟南芥中，PpPRR5同源基因AtPRR5被报道是植物特有的伪应答调节蛋白（Pseudo-Response Regulator）家族成员之一［11，12］。AtPRR5与家族其他成员协同调控了拟南芥生物钟节律［13］。超量表达AtPRR5表现出短日照提早开花和红光下呈现下胚轴变短的特征［14］；而Atprr5单突变体表现完全相反的表型［15］，三突变体（Atprr5 Atprr7 Atprr9）不仅表现出更为严重的相应缺失表型［16］，而且还呈现出抑制侧根形成和更高淀粉含量（特别是在黎明时期）的特点［17］。以上研究表明，AtPRR5响应光信号转导，并在控制开花时间和早期光形态建成方面具有重要的功能。

基于AtPRR5基因具有以上重要功能，研究者对其调控机理进行了深入探索。AtPRR家族是按照AtPRR9→AtPRR7→AtPRR5→AtPRR3→AtPRR1/AtTOC1的顺序从黎明到黄昏依次转录翻译到最高峰，并呈现出昼夜周期性规律，它们又共同对AtCCA1和AtLHY的表达具有反馈调节作用［13，18，19］。参与红光信号输入的转录调控者AtLNK1/AtLNK2能与AtRVE4/AtRVE8蛋白结合形成复合体，然后作用于AtPRR5启动子驱动 其表 达；而AtPRR5 反过 来与AtLNK1、AtLNK2、AtRVE4和AtRVE8的启动子结合，对其表达产生负反馈抑制效应［20］。AtPRR5还参与到翻译后水平调控：AtPRR5的转录水平和蛋白水平并不完全同步；在光形态建成早期阶段，AtZTL 蛋白能通过结合AtPRR5的PR结构域介导其泛素化降解；蓝光具有活化AtZTL的LOV 结构域作用，进而通过改变与AtPRR5的结合构象影响其蛋白稳定性［21］。以上研究表明，AtPRR5表达能受到昼夜光强变化和不同光质调控，并与重要功能基因在多种调控水平上发生互作。

前期研究表明，梨PpPRR5基因在调控光合作用中可能发挥重要功能［22］。其同源基因研究表明PRR5基因响应光信号的特性，但调控光合作用的机制尚未阐明。因此，进一步明晰PpPRR5对梨树光合作用的调控作用，对于挖掘关键基因加速梨树高光效分子育种以及探索高光效栽培措施具有重要意义。本研究比较分析了不同类型梨品种（包括砂梨、白梨以及西洋梨）光合作用差异，检测了PpPRR5基因在不同品种中的表达水平变化模式，该研究结果为进一步解析PpPRR5在梨树光合作用中的作用提供分子水平上的证据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与光合速率测定

不同梨品种的光合作用测定试验在湖北省农业科学院果树茶叶研究所梨遗传育种圃进行。供试梨品种为阿巴特（西洋梨）、伏茄（西洋梨）、砀山酥梨（白梨）、中梨1 号（白梨与砂梨的杂交种）、翠冠（砂梨）。各品种栽培管理一致，测定树冠向阳面的外围长势中庸的新稍中部（5～6 叶位），叶龄为90 d。净光合速率使用美国PP SYSTEMS 公司的CIRAS-3 便携式光合作用测定系统在上午9：00—10：00 进行测定。每个品种随机选择3 片叶作为3 次生物学重复，测定后迅速放进液氮，并于-80 ℃长期保存。

1.2 总RNA 提取、质量检测与cDNA 合成

利用RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒提取不同梨品种叶组织的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳评价RNA的完整性，NanoPhotometerTM-spectrophotometer（IMPLEN，Germany）检测其浓度。以总RNA 为模板，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，USA）进行cDNA 第一链的合成。上述操作过程均按照试剂盒说明书进行。

1.3 qRT-PCR 分析

实时荧光定量PCR 在ABI（Applied Biosytems）7500 机器上进行，qRT-PCR 反应体系为10 μL，其中包括0.5 μL cDNA，0.5 μL正向、反向引物，5 μL的2×SYBR GREEN PCR Master Mix（Applied Biosystems，USA），ddH2O 补齐至10 μL。qRT-PCR 反应程序为：50 ℃，5 min；40 个循环（95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min）。反应结束后进行熔解曲线分析，用于检测引物扩增的特异性。利用Primer Premier 5.0 软件设计PpPRR5定量引物，正向引物为5′-ATCATC ACTCTGGCTACTG-3′，反向引物为5′-CCTTTCAC GGGAACTGG-3′。选择在梨叶组织中稳定表达的SKD1和YLS8基因共同作为标准化因子［23］。基因的相对表达量分析用2-ΔΔCt法，每个样品做3 次生物学重复和4 次技术重复。

1.4 数据分析

运用IBM SPSS Statistics 19 软件对试验结果进行差异显著性检验，显著水平P≤0.05。

2 结果与分析

2.1 不同梨品种净光合速率差异

不同梨品种之间净光合速率存在差异，净光合速率由高到低依次为翠冠＞中梨1 号＞砀山酥梨＞伏茄＞阿巴特（图1）。由图1 可以发现，2 个西洋梨类（伏茄和阿巴特）品种光合能力相对较弱；砂梨类品种（翠冠）光合速率最高，且与西洋梨类和白梨类（砀山酥梨）有显著性差异；砀山酥梨和中梨1 号（白梨与砂梨的杂交种）光合速率居中。

图1 不同梨品种净光合速率

2.2 PpPRR5基因在不同梨品种中的表达变化模式

利用qRT-PCR 技术检测了PpPRR5在不同梨品种中的表达模式，发现PpPRR5表达水平在不同梨品种叶组织中存在显著性差异，其相对表达量由高到低的顺序是阿巴特＞伏茄＞砀山酥梨＞中梨1 号＞翠冠（图2）。PpPRR5在不同品种中的表达模式与净光合速率高低的变化趋势相反，暗示PpPRR5可能是梨光合作用的一个负调控因子。

图2 PpPRR5 基因在不同梨品种中的表达变化模式

3 小结与讨论

前期研究筛选出一个与梨树冠层光合作用密切相关的基因PpPRR5，发现相对于开张的冠层区域叶片（净光合速率值较高），PpPRR5在郁闭的冠层区域叶片（净光合速率值较低）中表达水平更高［22］。本研究进一步发现，PpPRR5表达水平与不同梨品种的光合作用能力呈负相关性（图2）。PpPRR5表达分析结果表明，该基因可能是一个梨树光合作用的负调控因子。其拟南芥同源基因AtPRR5被报道响应红光信号，靶基因直接参与到红光/远红光信号途径［11］。光谱检测分析发现，相对于高光效栽培模式，光合作用密切相关的红光含量在传统栽培模式的冠层内膛显著降低，这些变化的光信号可能是光合速率差异的主要环境因素［22］。基于前期研究结果以及前人对生物钟的研究认识，推测由于果园冠层环境和昼夜变化均存在不断变化的光信号，生物钟关键基因PpPRR5可能响应外界光信号并对梨树光合作用水平产生调控作用。未来可在梨中对PpPRR5进行深入的功能解析，并从靶基因互作这个角度进一步探索其调控光合作用的分子机制，为梨树高光效分子育种提供基因资源。