病理检测过表达白血病抑制因子对子宫内膜癌细胞耐受化疗药物的作用分析

2022-01-10 14:16李丹天津市宝坻区人民医院天津医科大学宝坻临床学院天津301800
首都食品与医药 2022年1期
关键词:紫杉醇培养液癌细胞

李丹(天津市宝坻区人民医院 天津医科大学宝坻临床学院,天津 301800)

子宫内膜癌属于临床上较为常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一,且随着人们生活方式的不断改变以及生活压力的与日俱增,该病的发病率正呈逐年攀升趋势,已成为严重威胁女性生命健康的重大疾病之一[1-2]。该病多见于绝经后女性,其中3/4的患者均在50岁以后发病,年轻患者的占比为2%-14%,近年来有年轻化趋势[3]。由于该病发病早期具有极强的隐匿性,绝大部分患者一经确诊便已是中晚期,丧失了手术根治的最佳时期,化疗是目前临床上用以治疗中晚期子宫内膜癌患者的关键方法[4]。其中铂类与紫杉醇类联合是临床上首选的化疗方案,但其普遍存在化疗不敏感以及诱导耐药情况,晚期患者经治疗后5年总生存率在25%左右[5]。因此,如何有效解决患者化疗耐受的方法显得尤为重要,亦是目前临床研究的热点。有研究表明,子宫内膜癌的发生和生长因子调节密切相关,多种生长因子及其相关肽类、子宫内膜各类细胞和卵巢分泌激素之间形成了互联网络,实现了对子宫内膜周期性改变起到复杂而有序的调控[6]。白血病抑制因子(LIF)属于白细胞介素-6(IL-6)家族重要成员之一,具有较为广泛的生物学活性,已被证实和多种疾病的发生、发展密切相关[7]。鉴于此,本文通过研究病理检测过表达LIF对子宫内膜癌细胞耐受化疗药物的作用,以期为该病患者的治疗方案制定提供科学依据,继而改善患者预后。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂 ①仪器:Synergy2多功能酶标仪;Mini Protean电泳、Mini Trans-Blot转膜设备以及CFX9荧光定量PCR系统(BIO-RAD);多功能成像系统(UVITEC);Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter)。②试剂:胎牛血清、100×青霉素-链霉素(P/S)以及DMEM/F12培养液均购自ThermoFisher;胰岛素(Merck);顺铂及紫杉醇(阿拉丁);CCK-8试剂盒(同仁);Annexin V-FITC/PI检测试剂盒(凯基);JC-1检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒以及RIPA裂解液(碧云天);Bcl-2、Bcl-XL、Bax抗体(Cell Signal)。

1.2 研究方法 ①细胞培养:对子宫内膜癌细胞RL95-2实施规范培养、传代扩增处理,最后保存在医院中心实验室液氮罐内。完全培养基为含10%胎牛血清、5mg/L胰岛素以及1%P/S的DMEM/F12培养液。其中细胞换液、传代、冻存以及复苏具体操作均遵循常规规范完成,细胞培养环境为5%CO2,37.5℃恒温。②细胞模型构建:转染前夜进行消化传代293FT细胞处理,并将其接种在明胶包被的培养介质中,放置在5%CO2,37℃条件下培养过夜。之后根据15∶8∶12比例充分混合pLVX-IRES-Puro、PMD2.G以及psPAX2,具体操作以说明书为准。采用Lipofectamine 3000转染混合物,5%CO2,37℃条件下培养6h。除去培养液,采用PBS重复冲洗3次,并加入完全培养基。转染过夜之后采集培养液上清,经0.2μm微孔滤膜过滤之后,直接转染细胞、正常培养。定时6-10h更换1次含病毒的培养液,持续3d。感染结束之后,更换完全培养液实施1d培养,待细胞恢复并长至90%融合度时,传代、冻存。针对传代过夜细胞,予以0.1-10mg/L的含Puro筛选培养液。③CCK-8法检测细胞活性:以96孔板为介质,以5000个细胞/孔的标准将细胞接种至孔板内,并放置在5%CO2,37℃条件下培养6h。培养完成之后,每孔内加入1/10培养液体积的CCK-8溶液,孵育60min后以酶标仪测定450nm处的吸光度。继续培养24h、48h、72h后完成上述操作,测定各孔450nm处的吸光度,并计算相对吸光度。④Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况:采用Annexin V-FITC/PI检测试剂盒完成,相关操作以试剂盒说明书为准,借助流式细胞分析仪实现细胞凋亡情况的检测。⑤JC-1法检测细胞线粒体膜电位情况:相关操作以试剂盒说明书为准,即根据实验分组处理细胞后,采集细胞孵育JC-1染液,采用流式细胞分析仪检测,调整并采集所有样品前散射光、侧散射光、绿光以及红光通道信号,以前散射光/侧散射光做散点图标记主细胞群,随后以绿光/红光对上述主细胞群作图分成绿光以及红光阳性的高线粒体膜电位细胞。⑥免疫印迹法检测Bcl-2家族蛋白表达水平:采用BCA蛋白定量试剂盒完成,相关操作以试剂盒说明书为准,以多功能成像仪自动成像观察蛋白相对表达水平。

1.3 统计学处理 数据处理工具选择SPSS22.0软件,计量数据以(±s)表示,开展正态性检验及方差齐性检验,符合正态分布,行t检验。计数资料的表示方式为[n(%)],开展χ2检验。以P<0.05为判定差异有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 两组细胞体外活性的影响 两组细胞24h、48h、72h相对吸光度对比均不明显(均P>0.05)。见表1。

表1 两组细胞体外活性的影响(±s)

表1 两组细胞体外活性的影响(±s)

组别 例数 24h相对吸光度 48h相对吸光度 72h相对吸光度过表达组 3 2.31±0.32 4.71±0.41 9.01±0.42对照组 3 2.25±0.31 4.34±0.32 8.82±0.36 t-0.310 1.232 0.595 P-0.772 0.285 0.584

2.2 两组化疗药物杀伤肿瘤细胞能力对比 过表达组子宫内膜癌细胞在顺铂及紫杉醇作用下的细胞凋亡率分别低于对照组(均P<0.05)。见表2。

表2 两组化疗药物杀伤肿瘤细胞能力对比(±s,%)

表2 两组化疗药物杀伤肿瘤细胞能力对比(±s,%)

组别 例数 顺铂 紫杉醇过表达组 3 27.58±2.69 31.26±2.78对照组 3 68.73±11.27 74.92±12.06 t-6.151 6.110 P-0.004 0.004

2.3 两组化疗药物破坏肿瘤细胞线粒体膜电位的作用效果对比过表达组子宫内膜癌细胞在顺铂及紫杉醇作用下的细胞线粒体膜电位分别高于对照组(均P<0.05)。见表3。

表3 两组化疗药物破坏肿瘤细胞线粒体膜电位的作用效果对比(±s,%)

表3 两组化疗药物破坏肿瘤细胞线粒体膜电位的作用效果对比(±s,%)

组别 例数 顺铂 紫杉醇过表达组 3 42.38±6.29 31.89±4.56对照组 3 17.26±3.12 12.74±2.15 t-6.197 6.579 P-0.003 0.003

2.4 两组Bcl-2家族蛋白表达水平对比 过表达组Bcl-2及Bcl-XL蛋白相对表达量分别高于对照组,而Bax蛋白相对表达量低于对照组(均P<0.05)。见表4。

表4 两组Bcl-2家族蛋白表达水平对比(±s)

表4 两组Bcl-2家族蛋白表达水平对比(±s)

组别 例数 Bcl-2 Bcl-XL Bax过表达组 3 2.71±0.31 1.74±0.12 -1.24±0.08对照组 3 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 t-15.141 25.115 26.847 P-0.000 0.000 0.000

3 讨论

有研究表明,功能性LIF属于分泌型糖蛋白之一,人类LIF基因主要定位于第22号染色体上,基因全长为6.0kb,含有3个外显子以及2个内含子,编码区内碱基存在较高的保守性[8-10]。LIF作为一种具备多种生物学功能的细胞因子,国内对其相关研究主要集中于生殖医学方面。LIF在生殖周期中和子宫功能以及调节子宫内膜生长密切相关,且子宫内膜腺上皮细胞是LIF表达的重要部位,LIF表达在一定程度上受月经周期变化影响,分泌期表达最高,可能和其在一定程度上受卵巢激素调节有关[11-13]。随着近年来相关研究的日益深入,越来越多的学者发现LIF存在多个可变剪切体,在功能方面存在一定的差异,而在实体瘤中,LIF主要扮演着功能性细胞因子的角色,促进了肿瘤的恶性进展以及放化疗抵抗[14-15]。

本文结果还显示了过表达组子宫内膜癌细胞在顺铂及紫杉醇作用下的细胞凋亡率均低于对照组。这提示了过表达LIF会增加子宫内膜癌细胞对化疗药物的耐受性,增强其对顺铂及紫杉醇的抵抗作用。究其原因,LIF可通过LIF受体增强STAT3的磷酸化水平和转录水平,继而对和疾病进展以及化疗抵抗相关的基因表达产生调控作用,进一步增强子宫内膜癌细胞对化疗药物的耐受性。这在国外学者YU[16]等人的研究报道中得以佐证:借助逆转录病毒建立稳定过表达LIF的结直肠癌细胞,可促进细胞大量分泌LIF,并对STAT3信号通路起到激活作用,促使P53蛋白表达水平下降,最终减弱化疗药物对肿瘤细胞的灭杀作用。此外,虽然顺铂及紫杉醇治疗子宫内膜癌的机制存在根本差异,但其均可对线粒体功能产生破坏,继而诱导细胞凋亡的发生,然而过表达LIF可有效稳定线粒体膜电位,抑制细胞凋亡。究其原因,可能和过表达LIF可激活STAT3信号通路,调控凋亡相关蛋白水平有关。由此可见,LIF可能介导了子宫内膜癌的恶性进展以及化疗抵抗,可能是该病的治疗靶点。此外,Bcl-2及Bcl-XL均是目前临床上应用较为广泛的抗凋亡蛋白,而Bax属于促凋亡蛋白。而本文结果发现过表达组Bcl-2及Bcl-XL蛋白相对表达量均高于对照组,而Bax蛋白相对表达量低于对照组。这充分说明了LIF影响子宫内膜癌耐受化疗药物的可能机制之一和调控上述细胞凋亡相关蛋白表达有关。

综上所述,过表达LIF会在一定程度上增加子宫内膜癌细胞对化疗药物的耐受性,增强其对顺铂及紫杉醇的抵抗作用,其主要作用机制可能和上调Bcl-2及Bcl-XL表达以及下调Bax表达有关。

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