丁三醇合成关键酶的筛选、酶学性质及体外催化

李 惑，曹雪飞，储建林，吴 斌

(1. 南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211800; 2. 南京工业大学药学院，江苏南京211800)

1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol,BT)是一种无色、无味、无毒的水溶性C4平台化合物，其为黏稠糖浆状，化学式为C4H10O3，分子量为106.12[1]；其2号碳原子为手性碳原子，具有旋光性，在醇类和水中有较高的溶解度，具有一定的吸湿性[2]。

1,2,4-丁三醇在合适的硝化体系中被完全硝化的产物是丁三醇三硝酸酯(BTTN)[3]，BTTN是一种含能增塑剂，与硝化甘油(NG)相比，它具有冲击感小、热稳定性高、毒性小、挥发性低及吸湿性低等优点，在炸药、推进剂等领域应用广泛[4-5]。1,2,4-丁三醇也是很多手性化合物的合成前体，以它为原料合成的缓释剂可用来控制药物的释放速度[6-8]。光学纯的1,2,4-丁三醇可以作为抗肿瘤、抗病毒、抗癌药物、血小板活性因子、降胆固醇药物及治疗皮肤病药物等药物制备的关键中间体[9-15]，如(S)-1,2,4-丁三醇的环化产物(S)-3-羟基-四氢呋喃是合成治疗艾滋病的药物Agenerase(一种HIV蛋白酶抑制剂)的重要中间体[16]。1,2,4-丁三醇用作烟草降焦油助剂，可以减弱硝基化合物对人体的毒害，从而降低焦油对人体的危害；作为防腐剂的添加剂，能够抑制微生物生长，增强防腐效果；作为彩色显影液的组分，可增加色彩度和黏着力；作为交联剂，可以提高聚合物的强度和硬度[17]。另外，1,2,4-丁三醇还可用作高级服装的表面处理剂、高级墨水防干剂、陶瓷加工助剂以及特殊用途的包装与储运等[18-20]。

迄今为止，在生物法合成1,2,4-丁三醇的途径中，α-酮酸脱羧反应中的关键酶仍然沿用Forst团队的Niu等[21]报道的来源于恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶MDLC。

本研究利用分子模拟技术，从京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)、酶数据库BRENDA等数据库中筛选可能催化3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸脱羧形成3,4-二羟基丁醛的酮酸脱羧酶，将其克隆至pEGX-6p-1后于E.coliDH5α中表达，比较目标酶的酶活力大小，对酶活力最高的脱羧酶进行纯化，并对其酶学性质进行分析及体外催化研究，为提高BT生物合成效率提供优异的新酶源。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株E.coliBL21、E.coliDH5α、质粒pGEX-6p-1、质粒pET-22b(+)，何冰芳教授实验室保存；E.coliBL21/pET22b-xylD，何冰芳教授实验室构建保存。质粒pUC57-mdlC、pUC57-kivD、pUC57-kdcA、pUC57-aro10和pUC57-pdc5，苏州金唯智生物科技有限公司合成。

各种限制性内切酶、DNA聚合酶、标准DNA、标准蛋白，TaKaRa公司。DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，Axygen公司；胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖，Oxoid公司；木糖酸，珍瑭生物科技有限公司；NaCl、Tris-base，进口或国产分析纯。

LB培养基[22](g/L)：蛋白胨10.0、NaCl 10.0、酵母粉5.0；固体培养基另加琼脂20.0。

LB+氨苄青霉素(Amp)培养基：LB培养基灭菌后冷却至60 ℃以下，再加入过滤除菌的Amp，使其终质量浓度分别为100 mg/L。

1.2 大肠杆菌的DNA操作

质粒提取、DNA酶切、连接、电泳、转化等DNA操作参照文献[22]进行。

1.3 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸-二磷酸硫胺(ThDP)反应中间体的结构构建

利用MOE软件(Chemical Computing Group)构建3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸的加H结构(图1(a))，采用MMFF94力场，优化几何三维结构，获得底物的三维结构；按照反应催化机制，将3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸接到辅基二磷酸硫胺素(ThDP)上——ThDP结构从酶的晶体结构中提取，构建反应中间体结构(图1(b))，并优化几何三维结构。

图1 底物3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸与中间体3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸-二磷酸硫胺的结构Fig.1 Structures of the substrate (3-deoxy-D-glyceropentanoglycan acid) and the intermediate (3-deoxy-D-glyceropentanoglycan acid-thiamine diphosphate)

1.4 同源建模

来源于Pseudomonasaeruginosa的5-胍基-α-含氧戊酸脱羧酶(ARUI)[23]、来源于Neurosporacrassa的丙酮酸脱羧酶(N-PDC)[24]、来源于Saccharomycescerevisiae的支链-α-含氧酸脱羧酶(S-PDC)[25]和来源于Lactococcuslactis的α-酮异戊酸脱羧酶(KIVD)[26]的晶体结构没有被解析出来，利用同源建模方法构建其三维结构。上述4个脱羧酶的模板结构来自PDB数据库，ID依次分别为6BD3、5EUJ、2VK4和2VBF。利用Discovery studio 2.55软件构建同源模型，并进行全局能量最小化计算。

1.5 分子对接

对接使用MOE软件。分子对接前，所有的蛋白质结构均去除水分子和原有配体；用MOE软件为蛋白质分配电荷和氢原子，并优化结构，力场采用Amber10：EHT。将小分子对接进入脱羧酶的活性中心，配体构象由键旋转生成，分子对接采用Triangle Matcher法，并用LondondG评分函数进行排名，输出100个构象(pose)，再用gbvi/wsadg评分功能进一步优化排序，使酶活性口袋中的能量最小化。

1.6 α-酮酸脱羧酶基因的克隆

根据筛选所得序列设计PCR引物及序列(表1)进行基因扩增，上下游引物的5’端分别设计了BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点。

表1 PCR引物及序列

PCR的反应体系：模板2 μL，上下游引物各2 μL，2×Priemix 25 μL，加重蒸水至50 μL。

反应条件：95 ℃预变性5 min后，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，进行32个循环，72 ℃延伸10 min。

1.7 表达载体的构建

将质粒与目标酶基因用BamHⅠ、XhoⅠ进行双酶切，得到的线性载体与目标酶基因用T4连接酶16 ℃连接8 h，导入感受态E.coliDH5α/E.coliBL21，得到重组质粒E.coliDH5α/pGEX-6p-1-mdlC、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-kivD、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-kdcA、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-aro10、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-pdc5。

1.8 目标酮酸脱羧酶的发酵培养及表达

将重组菌E.coliDH5α/pGEX-6p-1-mdlC、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-kivD、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-kdcA、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-aro10、E.coliDH5α/pGEX-6p-1-pdc5，加入含Amp的LB种子培养基中，在37 ℃、180 r/min摇床中培养12 h。以2%(体积分数)的接种量接入LB发酵培养基中，在37 ℃、180 r/min摇床中培养1.5～2 h，至OD600约为0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，于16 ℃下诱导表达，继续培养36 h后在4 ℃下8 000 r/min离心20 min收集沉淀菌体，破碎后离心，留上清液。

1.9 酶活检测

利用SDS-PAGE分析胞外上清液中的表达产物，并采用脱羧酶酶活检测的方法测定目标α-酮酸脱羧酶的酶活[27]。E.coliDH5α中含有BT合成途径中所需的木糖酸脱水酶和醇脱氢酶，通过醇脱氢酶将3,4-二羟基丁醛转化为BT过程中NADH的消耗来测量其活性。体系中含有50 mmol/L磷酸钾(pH6.5)、10 mmol/L木糖酸、0.15 mmol/L ThDP、0.2 mmol/L NADH、10 U乙醇脱氢酶、20 μL粗酶裂解物。因为醇脱氢酶是测定中最后一种酶，所以需要添加足够量的醇脱氢酶，使得醇脱氢酶的酶活不会对整体酶活产生影响。所测得的活性表示木糖酸转化生成3,4-二羟基丁醛所经历的2步酶反应的总活性。在96孔板中加入酶活测定的组分后混匀，在30 ℃下，340 nm处每隔1 min记录一次吸光值A340。筛选阶段为了简化实验，在酶活检测中所使用的脱羧酶均为粗酶液。酶学性质研究中所使用的均为纯酶液。

反应总酶活定义：一个单位的酶活定义为每分钟消耗1 μmol NADH的量(U)。

1.10 支链-α-酮酸脱羧酶(KDCA)、木糖酸脱水酶(XYLD)的纯化

将经水系滤膜过滤的细胞破碎上清液通过镍亲和层析柱纯化，收集目标酶出峰的洗脱液，于4 ℃透析以除去咪唑和盐。

取适当稀释的酶液，使用Bradfoard法测定蛋白质浓度，以牛血清蛋白(BSA)为标准。

木糖酸脱水酶的酶活定义为每分钟消耗1 μmol木糖酸的量。采用比色法检测木糖酸脱水酶酶活。

1)1,2,4-丁三醇体外催化。50 mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)、0.5 mmol/L 焦磷酸硫胺素(TPP)、10 mmol/L MgCl2、20 mmol/L木糖酸、0.375 mmol/L NADH、0.5 mg/L脱羧酶、0.5 mg/L木糖酸脱水酶、25 U醇脱氢酶。体外催化中所使用的酶均为纯酶。

2)1,2,4-丁三醇体外催化。将上述溶液加入1.5 mL离心管中混匀，在30 ℃、100 r/min控温摇床中避光转化24 h。

3)1,2,4-丁三醇液相检测方法。使用有机酸分析柱Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)检测1,2,4-丁三醇，流动相为5 mmol/L H2SO4水溶液，流速0.5 mL/min，进样量20 μL，柱温55 ℃，检测器为折光示差检测器。

2 结果与讨论

2.1 α-酮酸脱羧酶的虚拟筛选

根据底物特点，在KEGG等数据库中检索类似的基团反应。本研究从BRENDA数据库的脱羧酶EC 4.1.1-家族成员中选择了9种具有相似基团反应的不同来源不同种类的脱羧酶：支链-α-酮酸脱羧酶(KDCA)(Lactococcuslactis)[28]、5-胍基-2含氧戊酸脱羧酶(ARUI)(Pseudomonasaeruginosa)[23]、苯丙酮酸脱羧酶(ARO10)(Saccharomycescerevisiae)[29]、丙酮酸脱羧酶(L-PDC)(Lactococcuslactis)[25]、丙酮酸脱羧酶(N-PDC)(Neurosporacrassa)[24]、支链α-含氧酸脱羧酶S-PDC)((Saccharomycescerevisiae)[25]、丙酮酸脱羧酶(PDC1)(Saccharomycescerevisiae)[25]、吲哚丙酮酸脱羧酶(PDC5)(Saccharomycescerevisiae)[25]、α-酮异戊酸脱羧酶(KIVD)(Lactococcuslactis)[26]进行模拟筛选，以原有的苯甲酰甲酸脱羧酶作为对照。酶的氨基酸序列来源于Uniport蛋白质序列数据库(https:∥www.uniprot.org/)，索引号见表2。

表2 几种不同来源的α-酮酸脱羧酶的三维结构及序列

其中 KDCA、ARO10、L-PDC、PDC1和PDC5蛋白质晶体结构都已经解析，将从PDB蛋白质结构数据库(https:∥www.rcsb.org)中获得的蛋白质信息列在表2中，另外4个酶的三维结构用同源建模方法构建获得。

利用分子对接软件，将反应中间体与上述蛋白的活性中心逐一对接，并以原有的MDLC做对照，对目标酶进行筛选，获得可能更高效的脱羧酶，最后在实现筛选酶克隆表达和分离纯化的基础上，考察此酶的特性。脱羧酶家族(EC 4.1.1-)含有上百种不同来源、催化不同底物的脱羧酶。本研究根据催化底物特性，在KEGG数据库中搜索相似的基团反应，并对数据库大量的脱羧酶进行比较，选择了9个不同来源催化不同底物的α-酮酸脱羧酶进行筛选。

选取的9种α-酮酸脱羧酶都是ThDP依赖性的非氧化酶，在反应过程中，产生“底物-ThDP”的反应中间体。反应中间体在酶中的稳定与否，往往能够体现催化反应的强弱，因此我们构建了反应中间体，将该中间体与所选的9种α-酮酸脱羧酶进行了分子对接，并将MDLC作为对照，比较其结合自由能，分析其相互作用，从而进一步筛选更有效的催化蛋白质。

表3为不同来源的α-酮酸脱羧酶的对接自由能。由表3可知：反应中间体均能合适地对接到9种α-酮酸脱羧酶活性中心，并有比对照组MDLC更小的对接自由能(负绝对值大)，这说明选择的9种α-酮酸脱羧酶都有望替代原有的苯甲酰甲酸脱羧酶。尤其Lactococcuslactis来源的KDCA和Lactococcuslactis来源的KIVD的对接自由能相比对照组有更显著的优势，说明反应中间体与这些酶的亲和性远高于对照组，有望获得更高活性的α-酮酸脱羧酶。

表3 不同来源的α-酮酸脱羧酶的对接自由能

最终选择了Lactococcuslactis来源的KDCA、Saccharomycescerevisiae来源的ARO10、S.cerevisiae来源的PDC5和L.lactis来源的KIVD进行后续实验验证。

2.2 α-酮酸脱羧酶的克隆表达及酶活检测

2.2.1 α-酮酸脱羧酶的克隆表达

通过PCR扩增得到mdlC、kdcA、kivD、pdc5和aro10这5种脱羧酶的基因片段，通过酶切连接转化，经菌落PCR及测序验证，选择正确的菌落进行保存。由于E.coliDH5α自身存在木糖脱水酶以及醇脱氢酶基因，我们将目标脱羧酶基因克隆至E.coliDH5α中表达，可以简化后续酶活检测体系。将发酵破碎上清液进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图2。由图2可知：MDLC、KDCA和KIVD在大肠杆菌E.coliDH5α中均可表达，其表观分子量分别为5.6×104、5.6×104和6.1×104。然而酿酒酵母(S.cerevisiae)来源的ARO10和PDC5表达量很低，表达失败。

M—标准蛋白;1—pGEX-6p-1上清液；2—pGEX-6p-1沉淀；3—MDLC上清液；4—MDLC沉淀；5—KDCA上清液；6—KDCA沉淀；7—KIVD上清液；8—KIVD沉淀；9—ARO10上清液；10—ARO10沉淀；11—PDC5上清液；12—PDC5沉淀图2 重组酶的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the combinant recombinase

2.2.2 α-酮酸脱羧酶酶活测定

将发酵破碎离心后的上清液作为粗酶液用于脱羧酶酶活的检测，由于E.coliDH5α中含有木糖脱水酶以及醇脱氢酶的基因，为了简化筛选，选用粗酶液进行酶活检测。用BCA试剂盒检测粗酶液的蛋白含量，再结合蛋白灰度扫描确定酮酸脱羧酶的大致浓度，进行酶活力测定，结果见图3。由图3可知：MDLC、KDCA和KIVD均显示出明显的酶活，且KDCA和KIVD酶活力均高于MDLC，而ARO10和PDC5则无明显比酶活。而孙雷等[30]研究发现，KIVD的催化效率要优于MDLC，但KDCA还没有人对其进行讨论，我们筛选所得的KDCA比KIVD有更高的酶活性，是MDLC的1.93倍，因此KDCA比KIVD在生产BT方面更具有优势。

图3 α-酮酸脱羧酶的相对酶活力Fig.3 Relative enzyme activity of α-keto acid decarboxylase

2.3 KDCA在E.coli BL21中的表达及酶学性质分析

2.3.1 KDCA在E.coliBL21中的表达

由于E.coliDH5α并不是一个专门的蛋白表达宿主，因此，我们将支链-α-酮酸脱羧酶kdcA基因克隆至pET-22b(+)，转入蛋白表达宿主E.coliBL21中表达，结果见图4。由图4可知，KDCA成功在大肠杆菌BL21中表达。

图4 KDCA在E.coli BL21中表达Fig.4 Expression of KDCA in E.coli BL21

2.3.2 KDCA酶学性质分析

通过镍柱亲和层析分离获得纯的KDCA。KDCA的理论等电点为4.95，选择pH 7.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液 A平衡柱子，用缓冲液 B洗脱，收集对应的洗脱峰。木糖酸脱水酶XYLD为本实验室前期构建，为了后续检测，用相同的方法对XYLD进行纯化。

1)温度对重组酶活力及稳定性的影响。考察KDCA的最适催化温度及其热稳定性，结果见图5～6。由图5可知：KDCA的最适温度为30 ℃，与Wei等[28]报道的来源于Lactococcuslactis来源的KDCA的最适温度为45 ℃相比较低。由图6可知：KDCA在30 ℃孵育2 h后仍能保持其初始活性的90 %左右；当温度大于40 ℃孵育时，酶活降低显著；当温度达到60 ℃孵育时，几乎丧失其初始活性的90%以上。

图5 温度对KDCA活力的影响Fig.5 Effect of temperature on KDCA activity

图6 温度对KDCA稳定性的影响Fig.6 Effect of temperature on KDCA stability

2)pH对重组酶活力及稳定性的影响

考察pH对KDCA酶活的影响及其热稳定性，结果见图7～8。由图7可知：KDCA的最适pH为6.5，且pH为6.0～7.0时，具有较好的活性。这与Smit等[31]研究的Lactococcuslactis来源的KDCA的最适pH 6.3相近，与Wei等[28]发现在pH为6.0～7.0时它有广泛活性的结论一致。

图7 pH对KDCA的活力的影响Fig.7 Effect of pH on KDCA activity

图9 脱羧酶体外催化结果的HPLC分析Fig.9 HPLC chromatogram analysis of results of decarboxylase catalysis in vitro

由图8可知：KDCA在0 ℃、pH为6.0～7.0的条件下孵育2 h后，保留了其初始活性的80%以上；在pH大于8的条件下孵育2 h后，KDCA稳定性下降显著。这表明在pH为6.0～7.0时KDCA具有良好的pH稳定性。

图8 pH对KDCA稳定性的影响Fig.8 Effect of pH on KDCA stability

2.4 KDCA、KIVD及MDLC的体外催化性能

发酵制备KDCA、KIVD和MDLC这3种脱羧酶的粗酶液用于1,2,4-丁三醇无细胞催化，在30 ℃、100 r/min条件下避光催化，高效液相色谱(HPLC)检测MDLC、KDCA以及KIVD体外催化生产BT的产物，结果如图9所示。1,2,4-丁三醇标准品出峰时间为17.1 min，底物木糖酸标准品的出峰时间为11.7 min。由图9可知：作为对照的空质粒，无1,2,4-丁三醇产生；MDLC、KDCA以及KIVD均能合成1,2,4-丁三醇。MDLC、KDCA以及KIVD这3个脱羧酶催化生产BT的能力(从小到大)的顺序为MDLC(0.175 g/L)、KIVD(0.216 g/L)、KDCA(0.337 g/L)，该结果与酶活检测一致。KDCA体外催化24 h的BT产量为0.337 g/L，是MDLC的1.93倍。

3 结论

利用分子模拟技术，成功筛选出了一个较MDLC酶活力更高的脱羧酶——KDCA，经体外催化研究发现，其24 h的BT产量是MDLC的1.93倍，并对KDCA的酶学性质进行了研究，发现其最适反应温度为30 ℃，最适反应pH 为6.5，为提高BT生物合成效率提供了优异的新酶源。