基于网络药理学的准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌作用机制研究

杨 梅,迪丽美合日·迪力夏提,赵翡翠,2,3

(1.新疆医科大学第四临床医学院,新疆 乌鲁木齐,830000;2.新疆医科大学附属中医医院 药学部,新疆 乌鲁木齐 830000;3.新疆中药炮制研究重点实验室,新疆 乌鲁木齐,830000)

卵巢癌起病隐匿，约70%的患者发现时已属晚期，病死率居妇科恶性肿瘤的首位[1-2]。目前卵巢癌的治疗方法为手术、放疗和化疗，但化疗具有较强的毒副作用及耐药性，且复发率高[3-5]。中医研究[6]认为肿瘤是因正气亏虚，气滞、血瘀、痰结、湿聚、热毒等互相搏结，日久积滞形成肿块而导致，可采用乌头属的辛温之药以毒攻毒、开结破凝，以温阳散寒之法治疗肿瘤。现代药理研究[7]也证实乌头类中药对肿瘤治疗效果显著。准噶尔乌头是毛茛科植物准噶尔乌头的干燥块根，专产于中国新疆维吾尔自治区北部地区，作为哈萨克族重要的传统民族药材，准噶尔乌头在哈萨克族民间常被作为“药用乌头”，《哈萨克药志》等文献[8-10]记载其性味辛、苦、大热，有毒，炮制减毒后用于治疗风湿性关节炎、腹部肿块、肋间神经痛等。研究[11]表明准噶尔乌头炮制品具有一定的抗肿瘤活性，但作用机制尚不明确。网络药理学[12]关注整体性和系统性的特点与中医药学的整体观念相吻合，有助于探索中药多成分、多靶点、多途径的作用机制。本研究采用网络药理学方法预测准噶尔乌头炮制品的抗卵巢癌潜在作用机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验药物

准噶尔乌头及其炮制品、乌头属植物。目前国内外未见准噶尔乌头及其炮制品抗卵巢癌作用机制的文献且有关准噶尔乌头的文献很少，故本研究利用准噶尔乌头与乌头属植物具有化学亲缘性的特点扩大检索范围[13-15],收集准噶尔乌头及乌头属植物全部化学成分，并从中筛选活性成分纳入准噶尔乌头炮制品活性成分中研究。

1.2 数据库、分析平台及软件

本研究使用的数据库、分析平台及软件见表1。

表1 数据库、分析平台及软件

1.3 药物活性成分收集与筛选

通过TCMSP、BATMAN-TCM、TCM-ID及文献收集准噶尔乌头及其炮制品、乌头属植物所有化学成分。根据口服生物利用度(OB)与类药性(DL)对成分进行筛选。考虑到样本量及数据的复杂性，筛选标准定为:OB≥20%，DL≥0.14[16]。

1.4 药物作用靶点预测及有效活性成分-靶点网络图构建

通过PubChem数据库确认筛选出的活性成分，下载其2D结构导入Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测。借助TCMSP、BATMAN-TCM、TCM-ID数据库对确认的活性成分进行靶点预测。将获得的全部药物靶点去重，导入Uniprot数据库校正靶点信息，得到准噶尔乌头炮制品有效活性成分作用靶点。经Cytoscape 3.6.1可视化处理，构建有效活性成分-靶点网络图。

1.5 人卵巢癌靶点筛选

在TTD数据库中以“Ovarian cancer”为关键词，检索得到人卵巢癌相关靶点;在DisGeNET数据库中以“Ovarian cancer”为关键字进行检索，选取其中基因-疾病关联评分(score_gda)>0.05的靶点信息进行研究[17];在GeneCards数据库中以“Ovarian cancer”为关键字进行检索，选取其中相关度得分(relevance score)≥20的靶点信息进行研究[18]。

在GEO数据库中以“Ovarian cancer”为关键词检索相关芯片，获取编号为GSE18520的芯片文件和GPL570的芯片基因注释文件。该芯片数据包含53例卵巢癌标本和10例正常卵巢表面上皮(OSE)刷。对芯片数据进行基因差异表达在线分析，筛选出显著差异基因，筛选标准为:P<0.05,差异倍数(FC)>4[19]。应用R语言ggplot2程序包绘制火山图。最终获得人卵巢癌的差异表达基因。

将TTD、DisGeNET、GeneCard数据库中获取的人卵巢癌相关靶点与GEO数据库中获得的人卵巢癌差异表达基因取并集，将并集中的靶点信息导入Uniprot数据库进行校对，最终获得人卵巢癌相关靶点。

1.6 准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌关键靶点挖掘

将1.4标题内容中预测到的药物作用靶点与1.5标题内容中检索到的人卵巢癌潜在靶点经Draw Venn Diagram在线软件取交集，获得准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌关键靶点，并绘制维恩图。

1.7 “疾病-药物-成分-靶点”网络构建

将1.6标题内容中得到的准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌关键靶点与活性成分对应的靶点进行比对，筛选出能够作用到关键靶点上的活性成分，剔除未作用到关键靶点上的活性成分，整合对应有效活性成分，导入Cytoscape 3.6.1软件，构建“疾病-药物-成分-靶点”网络。

1.8 DAVID富集分析

采用DAVID数据库对关键靶点进行基因本体(GO)生物学功能分析及京都基因和基因组数据库(KEGG)富集分析。运用R语言ggPlot2程序包对GO富集分析结果中满足P<0.05且按P值升序排列的前20条结果绘制条形图，对KEGG富集分析结果中满足P<0.05且按P值升序排列的前20条结果绘制气泡图。

1.9 关键靶点蛋白互作网络构建

将1.6标题内容中挖掘出的关键靶点映射到String数据库，选择物种为人，以最低要求互动得分0.7为筛选参数[20]，对结果进行整合，借助Cytoscape 3.6.1进行可视化处理，构建准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌的关键靶点蛋白质互作(PPI)网络图并进行网络分析。

2 结 果

2.1 准噶尔乌头炮制品活性成分

从TCMSP、BATMAN-TCM、TCM-ID及文献中获得准噶尔乌头及其炮制品、乌头属植物化学成分577个，按照同时满足OB≥20%、DL≥0.14的标准筛选出有效活性成分41个。

2.2 准噶尔乌头炮制品作用靶点及有效活性成分-靶点网络图

通过PubChem数据库对41个有效活性成分确认后，借助Swiss Target Prediction、TCMSP、BATMAN-TCM、TCM-ID预测有效活性成分靶点，得到有对应靶点的有效活性成分30个，见表2。经Cytoscape 3.6.1进行可视化处理，构建有效活性成分-靶点网络图，其中有效活性成分的作用靶点627个，有效活性成分与对应靶点间存在1 703个相互关系。见图1。

2.3 人卵巢癌作用靶点

在TTD、DisGeNET、GeneCards数据库中分别获得人卵巢癌靶点42、70、788个。在GEO数据库中获得1 145个显著差异基因(去重后为1 139个)，其中上调基因516个，下调基因629个，绘制人卵巢癌差异基因火山图，见图2。将上述4个数据库中获得的人卵巢癌靶点及人卵巢癌显著差异基因取并集，经Uniprot数据库校对，最终得到人卵巢癌靶点1 667个。

表2 准噶尔乌头炮制品有效活性成分信息

2.4 准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌关键靶点

将627个准噶尔乌头炮制品有效活性成分作用靶点与1 667个人卵巢癌靶点经Draw Venn Diagram在线软件取交集，获得准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌关键靶点152个，并以“靶点名称(缩写)”的形式表示:即72 kDa type IV collagenase(MMP2)、transketolase(TKT)、estradiol 17-beta-dehydrogenase 1(HSD17B1)、estradiol 17-beta-dehydrogenase 2(HSD17B2)、high affinity nerve growth factor receptor(NTRK1)、matrilysin(MMP7)、nitric oxide synthase(NOS2)、fibroblast growth factor receptor 1(FGFR1)、hepatocyte growth factor receptor(MET)、cytochrome P450 2D6(CYP2D6)、C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 1(C5AR1)、G1/S-specific cyclin-E1(CCNE1)、amine oxidase (flavin-containing)A (MAOA)、cyclin-dependent kinase 1(CDK1)、focaladhesionkinase1(PTK2)、sexhormone-bindingglobulin(SHBG)、cholinesterase(BCHE)、apoptosisregulatorBcl-2(BCL2)、phosphatidylinositol4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitbetaisoform(PIK3CB)、endothelin-1receptor(EDNRA)、gonadotropin-releasinghormonereceptor(GNRHR)、beta-secretase2(BACE2)、retinoicacidreceptorbeta(RARB)、aurorakinaseA(AURKA)、alpha-1Aadrenergicreceptor(ADRA1A)、arylhydrocarbonreceptor(AHR)、dihydrofolatereductase(DHFR)、aurorakinaseB(AURKB)、aromatase(CYP19A1)、latelet-derivedgrowthfactorreceptorbeta(PDGFRB)、integrinbeta-1(ITGB1)、mast/stemcellgrowthfactorreceptorKit(KIT)、tyrosine-proteinkinaseJAK2(JAK2)、prostaglandinG/Hsynthase2(PTGS2)、G1/S-specificcyclin-D1(CCND1)、neuropeptideYreceptortype1(NPY1R)、estrogenreceptor(ESR1)、cyclin-dependentkinase4(CDK4)、thymidylatesynthase(TYMS)、cGMP-inhibited3′,5′-cyclicphosphodiesteraseA(PDE3A)、dualspecificitymitogen-activatedproteinkinasekinase4(MAP2K4)、phosphatidylinositol4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitdeltaisoform(PIK3CD)、cyclin-A2(CCNA2)、interstitialcollagenase(MMP1)、solutecarrierfamily2(SLC2A1)、indoleamine2,3-dioxygenase1(IDO1)、vascularendothelialgrowthfactorreceptor1(FLT1)、tyrosine-proteinkinasereceptorUFO(AXL)、mitogen-activatedproteinkinase1(MAPK1)、matrixmetalloproteinase-14(MMP14)、E3ubiquitin-proteinligaseMdm2(MDM2)、epidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)、receptortyrosine-proteinkinaseerbB-2(ERBB2)、mitogen-activatedproteinkinase8(MAPK8)、proteinase-activatedreceptor1(F2R)、tyrosine-proteinkinaseABL1(ABL1)、highaffinitycAMP-specific3′,5′-cyclicphosphodiesterase7A(PDE7A)、mitogen-activatedproteinkinase12(MAP3K12)、beta-glucuronidase(GUSB)、serine/threonine-proteinkinaseChk2(CHEK2)、telomerasereversetranscriptase(TERT)、proto-oncogenetyrosine-proteinkinaseSrc(SRC)、cyclin-dependentkinase2(CDK2)、progesteronereceptor(PGR)、serine/threonine-proteinphosphatase2Acatalyticsubunitalphaisoform(PPP2CA)、steroid17-alpha-hydroxylase/17,20lyase(CYP17A1)、gamma-aminobutyricacidreceptorsubunitbeta-3(GABRB3)、plasminogen(PLG)、serine/threonine-proteinkinasePAK4(PAK4)、phosphatidylinositol3-kinaseregulatorysubunitalpha(PIK3R1)、acetyl-CoAcarboxylase2(ACACB)、beta-3adrenergicreceptor(ADRB3)、isocitratedehydrogenase1(IDH1)、histonedeacetylase1(HDAC1)、P2Xpurinoceptor7(P2RX7)、estrogenreceptorbeta(ESR2)、ephrintype-Breceptor4(EPHB4)、cytochromeP4501B1(CYP1B1)、M-phaseinducerphosphatase1(CDC25A)、prostaglandinE2receptorEP3subtype(PTGER3)、deoxycytidinekinase(DCK)、arachidonate5-lipoxygenase(ALOX5)、protein-glutaminegamma-glutamyltransferase2(TGM2)、tyrosine-proteinphosphatasenon-receptortype11(PTPN11)、serine/threonine-proteinkinasePLK1(PLK1)、dipeptidylpeptidase4(DPP4)、serine/threonine-proteinkinaseChk1(CHEK1)、kinesin-likeproteinKIF11(KIF11)、potassiumvoltage-gatedchannelsubfamilyHmember2(KCNH2)、peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma(PPARG)、proteinkinaseCdeltatype(PRKCD)、proto-oncogenetyrosine-proteinkinasereceptorRet(RET)、multidrugresistanceprotein1(ABCB1)、cannabinoidreceptor1(CNR1)、glucocorticoidreceptor(NR3C1)、serine/threonine-proteinkinasemTOR(MTOR)、integrin-linkedproteinkinase(ILK)、mitogen-activatedproteinkinase14(MAPK14)、cyclin-dependentkinase6(CDK6)、tyrosine-proteinkinaseCSK(CSK)、RAFproto-oncogeneserine/threonine-proteinkinase(RAF1)、gamma-aminobutyricacidreceptorsubunitbeta-2(GABRB2)、signaltransducerandactivatoroftranscription3(STAT3)、sphingosinekinase1(SPHK1)、TGF-betareceptortype-1(TGFBR1)、type-1angiotensinⅡreceptor(AGTR1)、cathepsinD(CTSD)、Kelch-likeECH-associatedprotein1(KEAP1)、inducedmyeloidleukemiacelldifferentiationproteinMcl-1(MCL1)、G1/S-specificcyclin-D3(CCND3)、interleukin-6(IL6)、heatshockproteinHSP90-alpha(HSP90AA1)、poly(ADP-ribose)polymerase1(PARP1)、vitaminD3receptor(VDR)、max-likeproteinX(MLX)、rho-associatedproteinkinase1(ROCK1)、vascularendothelialgrowthfactorreceptor2(KDR)、UDP-N-acetylglucosamine-peptideN-acetylglucosaminyltransferase110kDasubunit(OGT)、ATP-bindingcassettesub-familyGmember2(ABCG2)、multipleendocrineneoplasia1(MEN1)、retinoicacidreceptoralpha(RARA)、tyrosine-proteinphosphatasenon-receptortype1(PTPN1)、beta-secretase1(BACE1)、phosphatidylinositol4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitgammaisoform(PIK3CG)、NAD(P)Hdehydrogenase(quinone)1(NQO1)、phosphatidylinositol4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitalphaisoform(PIK3CA)、Interleukin-2(IL2)、DNAtopoisomerase2-alpha(TOP2A)、insulin-likegrowthfactor1receptor(IGF1R)、calcitoningene-relatedpeptidetype1receptor(CALCRL)、intercellularadhesionmolecule1(ICAM1)、Bcl-2-likeprotein1(BCL2L1)、mitogen-activatedproteinkinase3(MAPK3)、inhibitorofnuclearfactorkappa-Bkinasesubunitepsilon(IKBKE)、hypoxia-induciblefactor1-alpha(HIF1A)、Toll-likereceptor4(TLR4)、tyrosine-proteinkinaseJAK1(JAK1)、fattyacid-bindingprotein(FABP4)、G1/S-specificcyclin-D2(CCND2)、RAC-alphaserine/threonine-proteinkinase(AKT1)、dualspecificitymitogen-activatedproteinkinase1(MAP2K1)、highaffinitycAMP-specificandIBMX-insensitive3′,5′-cyclicphosphodiesterase8B(PDE8B)、prostaglandinG/Hsynthase1(PTGS1)、macrophagecolony-stimulatingfactor1receptor(CSF1R)、transcriptionfactorAP-1(JUN)、dualspecificityproteinkinaseTTK(TTK)、androgenreceptor(AR)、proteinkinaseCalphatype(PRKCA)、trypsin-1(PRSS1)、ribosomalproteinS6kinasebeta-1(RPS6KB1)、matrixmetalloproteinase-9(MMP9)、DNAtopoisomerase1(TOP1)。绘制的维恩图见图3。

2.5 “疾病-药物-成分-靶点”网络图

应用Cytoscape 3.6.1软件构建“疾病-药物-成分-靶点”网络图，该网络中共有181个节点，其中红色为疾病节点，共1个;蓝色为药物节点，共1个;紫色为成分节点，共27个(剔除了3个未作用到关键靶点上的活性成分);绿色为靶点节点，共152个;共663条边。见图4。

2.6 DAVID富集分析

通过DAVID数据库富集分析获得GO条目559条(P<0.05),其中生物过程(BP)条目404个，主要包括蛋白磷酸化、信号转导、细胞增殖正调控等;细胞组成(CC)条目67个，主要包括细胞周期素依赖性蛋白激酶全酶复合物、磷脂酰肌醇-3-激酶复合物等;分子功能(MF)条目88个，主要包括ATP结合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸激酶活性等。按P值排序，将每个模块前20位条目使用R语言ggplot2程序包绘制条形图，横坐标为富集基因的个数，柱的颜色代表-log10(P)值的大小，颜色由蓝到红表示-log10(P)值递增，见图5。

通过DAVID数据库对关键靶点进行KEGG通路富集分析得到108条通路(P<0.05),其中包括癌症途径、PI3K/Akt信号通路、VEGF信号通路、HIF-1信号通路等。按P值排序，选取前20位通路，使用R语言ggplot2程序包绘制气泡图，横坐标表示该通路所富集的基因占总体输入基因的比率，气泡颜色越红提示-log10(P)值越大，表示KEGG通路富集越显著，气泡越大表示KEGG通路越重要，见图6。

2.7 关键靶点PPI网络

152个关键靶点映射到String数据库，隐藏无相互关联的靶点，获得关键靶点相互作用网络图，包含148个靶点(4个靶点未参与),1 052条边，平均自由度为13.8,平均局部聚类系数为 0.54。借助Cytoscape 3.6.1进一步进行可视化处理，构建出准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌的关键靶点PPI网络图，并使用Cytoscape 3.6.1 软件中Network Analyzer工具对网络中的节点进行相关参数分析，其中degree值越大、节点越大、节点的颜色越深，节点的颜色由绿色变为橙色，表示该节点越重要;combine score值越大、边越粗，表示由该边代表的靶点间关系越密切，见图7。

2.8 核心靶点分析

通过Cytoscape 3.6.1计算,PPI网络中节点的度值的中位值为24.500,介数的中位值为302.240,紧密度的中位值为0.164,度值、介数和紧密度均超过中位值的靶点共18个，分别为AKT1、MAPK1、PIK3CA、STAT3、SRC、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1、EGFR、MAPK8、JAK2、IL6、CCND1、JUN、MMP9、ESR1、MAPK14、AR。这些节点可能是准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌的核心靶点。

3 讨 论

卵巢癌是严重危害女性健康的常见恶性肿瘤之一。目前，化疗药物的毒副作用和耐药是卵巢癌治疗中的重要问题。中医[6]认为肿瘤属“积聚”“癥瘕”等范畴，采用乌头类大辛大温之品，以其温阳散寒之功治疗肿瘤已得到医学界的认可[21]。准噶尔乌头在哈萨克族民间作为“药用乌头”长期使用，研究[11]表明，准噶尔乌头具有一定的抗卵巢癌活性，但作用机制不明确。

本研究发现准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌活性成分27个，包括准噶尔乌头碱、脱氧乌头碱、次乌头碱、亚油酸甲酯等。准噶尔乌头碱、脱氧乌头碱、次乌头碱是准噶尔乌头中已明确的化学成分[22-23],其余活性成分是根据准噶尔乌头与乌头属植物具有化学亲缘性的特点[13-15],通过以乌头属植物代表性化学成分扩大数据库检索范围而收集到的乌头属植物含有的化学成分。本研究预测出准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌作用靶点可能是PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、EGFR、MAPK1、MAPK3、CDK6等。PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)的催化异构体。PI3K是原癌基因，能磷酸化磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇4-磷酸和磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3),PIP3招募PH结构域蛋白到细胞膜，包括AKT1和PDPK1,从而激活涉及细胞生长、生存、增殖、运动和形态的信号级联，发挥关键作用[24]。EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，能激活多种下游信号通路，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[25-26]。研究[27]表明EGFR是解决上皮性卵巢癌化疗耐药问题新的治疗靶点。MAPK1、MAPK3属于丝/苏氨酸蛋白激酶,MAPK在许多肿瘤中都表现出异常表达，在卵巢癌组织中,MAPK1、MAPK3均高表达，表明其在卵巢癌中可能被异常激活,MAPK1、MAPK3可能是卵巢癌的作用靶点[28]。CDK6作为重要的细胞周期促进因子，参与诱导肿瘤细胞的增殖,CDK6过表达在卵巢癌发病和导致不良预后方面发挥了重要的作用,CDK6可作为潜在靶点用于卵巢癌的治疗[29]。

本研究预测出准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌信号通路有癌症途径、PI3K/Akt信号通路、VEGF信号通路、HIF-1信号通路等，其中PI3K-Akt信号通路通过多种途径抑制肿瘤细胞凋亡。PI3K/Akt 信号通路通过活化PI3K 后产生PIP3，进而活化Akt，促进肿瘤血管形成，加剧肿瘤侵袭和转移[30]。卵巢癌的发生、发展以及化疗耐药都与PI3K/AKT信号通路的过度激活密切相关，该通路能够介导卵巢癌细胞的迁移和侵袭，抑制卵巢癌细胞的凋亡和自噬[31-33]。VEGF信号通路是上皮性卵巢癌多药耐药相关信号通路之一[34]。研究[35]表明，通过使用血管抑制剂竞争性结合血管内皮生长因子受体的激酶结构域，可以抑制VEGF通路，从而明显提高晚期卵巢癌患者的存活率。缺氧是实体肿瘤微环境的基本特征之一，肿瘤内的缺氧环境与肿瘤的侵袭、转移密切相关[36-37]。HIF-1是在缺氧条件下普遍存在的重要调节因子[38-39],HIF-1由α亚基(α亚基影响HIF-1的活性)和β亚基(β亚基是结构性亚基)构成[40-41]。HIF-1对基因表达的调节导致葡萄糖摄取和氧化，能量产生和血管生成的改变，进而调节多种靶基因转录，使得糖酵解限速酶激活，有氧糖酵解增加、葡萄糖摄取率提高等，从而促进肿瘤细胞在缺氧或低氧条件下增殖、侵袭及转移[42-43]。研究[44-45]表明，通过抑制HIF-1α途径，可以下调HK2、LDHA表达，从而抑制卵巢癌细胞的糖酵解，有效抑制卵巢癌细胞增殖。

综上所述，本研究通过综合运用网络药理学技术探讨准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌可能的关键靶点及分子机制，为治疗卵巢癌提供新的切入点，为民族药的开发利用提供新的思路。由于本研究结论是借助网络药理学技术对数据库进行挖掘得出，为保证网络药理学预测结果的可靠性和准确性，后续仍需进一步实验验证。