LncRNA CRNDE与甲状腺乳头状癌的预后及免疫浸润的相关性

居悦俊,沈 婷,陈 刚,孔颖宏

(江苏省常熟市第二人民医院,1.内分泌科,2.超声科,江苏 常熟,215500)

甲状腺癌是最常见的内分泌系统肿瘤[1],受该病影响最严重的是中年妇女，其中约85%为甲状腺乳头状癌(PTC)[2-3]。PTC的分化良好，周边的侵犯性低，通过手术切除通常可以治愈，并且5年生存率超过95%[4]。但是,PTC有时会分化为更具侵袭性和致命性的甲状腺癌。另外，约30%的PTC患者中观察到复发[5]。因此，有必要对该疾病的分子特征进行进一步分析。目前，已经在大多数PTC病例中发现了高频率激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中编码效应子的基因的体细胞变化，这些基因在细胞凋亡中起重要作用[6]。目前，已鉴定出许多与PTC致癌相关的潜在生物标志物[包括金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)、血小板衍生生长因子(PDGF)和上皮muctin-1(MUC-1)],但有关其分子机制仍存在不确定性[7-9]。本研究通过公共数据库及本院甲状腺细针穿刺数据探索LncRNA CRNDE在PTC中的表达情况及其与预后及免疫浸润的关系。

1 资料与方法

1.1 RNA测序数据和生物信息学分析

使用TCGA数据库，从395例甲状腺癌(THCA)项目(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga/studied-cancers/thyroid)中收集PTC RNA序列(RNA-seq)数据和临床信息，其中58例有匹配的邻近组织。下载的数据格式为每百万千碱基(FPKM)3级高通量测序片段，然后转换为每百万转录本(TPM)格式以供后续分析。同时下载了GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的GSE60542数据集的33例PTC组织和29例癌旁组织，以及基因型-组织表达数据库 (GTEx,https://gtexportal.org/home/eqtls/tissuetissueName=Thyroid)中653例正常甲状腺组织的TPM格式的RNA-seq数据。本研究中执行的所有程序均符合赫尔辛基宣言(2013年修订)。

1.2 样本CRNDE 和BRAF V600E突变检测

标本来源:选取2020年8月—2020年12月在本院内分泌科行甲状腺结节细针穿刺(FNA)的标本，按甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统(TBSRTC),选取良性结节及PTC各40例。

CRNDE检测:使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific,美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)提取总RNA并进行逆转录。在Applied Biosystems 7500进行实时定量聚合酶链式反应(qPCR),使用2-△△Ct法计算相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表达的mRNA表达。BRAF V600E突变检测:检测采用qPCR检测人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒(艾得生物，中国厦门)。所有测量均根据标准方案进行。

1.3 免疫浸润分析

PTC的免疫浸润分析是通过来自R包ggstatsplot方法[10]进行的，描述了CRNDE与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及髓样树突状细胞免疫评分之间的相关性。

1.4 统计分析

所有统计分析均使用R(v.4.0.3)进行。使用Wilcoxon秩和检验分析CRNDE在各数据集中的表达情况,t检验及卡方检验分析临床病理特征与CRNDE之间的关系。使用Kaplan-Meier方法计算TCGA患者的存活率。使用Cox比例风险模型进行单变量和多变量分析，以估计临床和遗传临床特征与总生存率(OS)之间的关联。Spearman分析CRNDE与免疫细胞评分之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CRNDE在PCT中高表达

首先分析了CRNDE在TCGA泛癌中的表达，可以确认THCA数据集中有显著表达差异(P<0.001,图1A)。CRNDE在58个PTC组织中表达水平为(2.062±0.942),CRNDE在58个配对癌旁组织中表达水平为(1.550±0.560),CRNDE在PTC中高表达，差异有统计学意义(P<0.001,图1B)。同时还分析了TCGA中395个PTC组织及GTEx数据库中653个正常甲状腺组织中的CRNDE表达,CRNDE在PTC组织中显著高表达(P<0.000 1,图1C)。受试者工作特征(ROC)曲线分析CRNDE表达水平，区分PTC与非肿瘤组织的有效性及敏感性,CRNDE的曲线下面积(AUC)为0.839 7(P<0.000 1,图1D)。

通过Wilcoxon秩和检验分析GEO数据库中GSE60542数据集中33例PTC组织及29例癌旁组织中CRNDE的表达，发现CREND在PTC中显著高表达(P=0.000 6,图2A)。非配对样本t检验对FNA数据分析显示,CRNDE在PTC组织中表达为(2.797±0.168),在Ⅱ级分类良性结节中表达为(2.661±0.147),差异有统计学意义(t=2.938,P=0.003 8,图2B)。Spearman相关性分析显示,CRNDE与BRAF V600E显著相关(r=0.714,P<0.000 1,图2C)。

2.2 CRNDE表达与 PTC的临床病理特征的关系

从TCGA数据库收集了395个具有临床和基因表达数据的原发性PTC。根据CRNDE相对表达的平均值，将PTC患者分为高表达组(n=198)和低表达组(n=197),评估CRNDE的表达水平与PTC患者临床病理特征之间的关联。卡方检验显示CRNDE表达与T分期、N分期、M分期、TNM分级无相关性(P>0.05)。见表1。

2.3 CREND表达与PTC患者OS之间的关系

CREND的表达与PTC患者的OS呈正相关(P=0.012 6)。见图3。

2.4 PTC预后因素的Cox单因素和多因素分析

Cox单因素回归模型中(图4A)显示,CRNDE(P<0.000 1)、年龄(P<0.000 1)、T分期(P=0.000 7)、TNM分期(P<0.000 1)与PTC预后相关。多因素分析进一步显示(图4B),CRNDE(P=0.001 6)、年龄(P<0.000 1)是PTC患者OS的独立预后因素。

表1 CRNDE表达与PTC的临床病理特征

2.5 CRNDE表达与免疫浸润的相关性

CRNDE的表达与B细胞、CD8+T细胞及巨噬细胞的浸润水平呈正相关(P<0.05,图5A、C、D),与CD4+T细胞的浸润水平呈负相关(P<0.000 1,图 5B)。

3 讨 论

PTC被认为是遗传背景和预后极为不同的癌症，特征是多种生物学行为，从轻微到极具侵略性，这些是由于癌症亚型的基因突变不同导致[11-13]。随着qPCR及高通量测序技术的成熟，大量的PTC基因数据呈现在公共数据库中。目前，研究[14]认为PTC的基因表达谱足够稳定，可用于诊断，即使癌细胞未超过肿瘤基质，也很容易检测到。

lncRNA可调节包括PTC在内的各种癌症的进展，促进癌细胞的增殖、侵袭、迁移和耐药[15]。体外实验[16]表明,CRNDE通过竞争性结合miR-384,在PTC中促进细胞增殖、侵袭和迁移。本研究表明,lncRNA CRNDE在PTC中上调,CRNDE高表达与PTC患者较差的生存期相关。研究[17]认为,lncRNA CRNDE产生的有效危险因素评分能够评估PTC患者的预后，且将其分组后，高风险组的预后不佳，这与本研究结果相似。肿瘤浸润免疫细胞已被证明与PTC的肿瘤进展和预后相关[18]。研究[19]表明,T细胞和 B 细胞对甲状腺进行淋巴浸润的细胞免疫反应，以及导致特异性抗体产生体液免疫反应。本研究结果显示,CRNDE与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞及巨噬细胞的浸润水平相关,CRNDE可能参与PTC发生的免疫反应，导致PTC患者预后不良。免疫反应参与PTC,导致其预后不良的机制尚不明确，目前认为有以下几种可能:先前存在的免疫炎性反应导致恶性肿瘤;免疫围绕先前存在的肿瘤细胞，导致特定的免疫反应;免疫耐受导致恶性肿瘤。本研究表明，在THCA中,CRNDE与患者的肿瘤分期无关。目前研究[1]显示,PTC中BRAF V600E突变等位基因的平均百分比为25.3%,80.0%的肿瘤BRAF V600E呈阳性，本研究显示BRAF V600E突变样本中在CRNDE呈现高表达，提示CRNDE与BRAF V600E突变可能存在相关性，但目前大样本量的相关研究较少。

本研究基于TCGA数据库，验证样的GEO及实验样本为小样本资料;TCGA的主要目的不是获得全面的临床数据，一些重要的临床因素，如TMN分期及预后数据受到限制，故存在一定局限性，需要进一步的前瞻性临床试验来验证结果。Lnc CRNDE在PTC中的分子机制并未完全阐明，也仍需进一步验证。

综上所述,LncRNA CRNDE在PTC中高表达，与PTC的BRAF V600E突变、不良预后、免疫浸润存在相关性。LncRNA CRNDE可能是评估PTC的一种有前景的预后生物标志物。