金纳米颗粒碳电极固载布鲁氏菌抗体免疫传感器的研究

吴海云，孙雪梅，曾雅楠，于亚萍，杨仁杰，卫勇，通信作者

金纳米颗粒碳电极固载布鲁氏菌抗体免疫传感器的研究

吴海云1，孙雪梅2，曾雅楠1，于亚萍1，杨仁杰1，卫勇1，通信作者

（1. 天津农学院 工程技术学院，天津 300392；2. 天津市南开翔宇国际学校，天津 300110）

提出并建立一种金纳米颗粒修饰碳电极固载布鲁氏菌抗体免疫传感器，用于布鲁氏菌的快速检测。采用丝网印刷金纳米颗粒碳电极作为工作电极，利用金纳米颗粒表面积大的特点，在工作电极表面修饰布鲁氏菌抗体，构建电化学三电极体系。通过循环伏安法（CV法）表征免疫电极的电化学反应过程。以氧化峰电流的变化值（Δpa）作为电流响应信号，PBS缓冲液为空白对照，结果表明布鲁氏菌抗原与抗体免疫结合导致氧化峰电流减小，而无菌的PBS缓冲液电流值则几乎没有变化，用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌代替布鲁氏菌进行检测，干扰菌的响应信号与空白液相当，因此免疫传感器对布鲁氏菌有较好的特异性。

布鲁氏菌；金纳米颗粒；免疫传感器；循环伏安法；电化学

布鲁氏菌病（简称“布病”）是由布鲁氏菌属的细菌引起的传染—变态反应性人畜共患传染病[1]。依据《中华人民共和国传染病防治法》，布病是37种传染病中的乙类传染病[2]。被列为《家畜家禽防疫条例实施细则》中二类动物疾病之首，严重威胁人们身心健康。

目前，布病检测方法主要包括细菌学和血清学两种方法，常见的血清方法有试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）、虎红平板凝集试验（RBPT）等[3]。血清学方法主要基于对家畜布病抗体的检测，在实际应用时必须逐头采血，分离血清，劳动量相当大，而且血清特异性抗体出现在感染的2～4周，不利于疾病的早期诊断。与抗体检测法相比，检测布病病原法更直接，检测结果也更可靠。但该方法操作时需非常谨慎，对操作者人身安全危险较大，所需实验室条件较高，一般在BSL.2级实验室操作，很难在布病快速诊断及控制方面推广[4-5]。因此，开发高灵敏免疫传感器及建立快速的检测方法，对布病细菌的检测具有重要的理论意义和实际应用价值。

电化学生物传感器是一种快速检测致病菌的方法。在病菌的快速检测方面，一些学者展开了相关研究。文献[6-9]报道了基于电化学免疫传感器，成功用于禽流感（H5N1）抗体、大肠杆菌O157：H7等的检测。基于抗原-抗体的免疫反应导致电极表面电化学特性变化的原理，WU等[10]提出了一种阻抗型电化学免疫传感器用于布鲁氏菌的快速检测；杨威等[11]采用丝网印刷金电极表面修饰巯基乙胺绑定抗原的方法，实现了布鲁氏菌抗体的快速检测。同时，研究发现纳米尺寸的功能颗粒能够在单位面积上固定大量的生物分子，形成高效的生物传感膜或生物质剂，利用生物分子的直接吸附，可显著提高分析体系的灵敏度[12-13]。

本研究构建了基于金纳米颗粒修饰碳电极固载布鲁氏菌抗体免疫传感器。利用金纳米颗粒较强的吸附能力和良好的电子传递能力，不仅可以增加抗体的固定量，还可以增强电子在电极和抗原之间的传递。研究了电极的循环伏安特性，并将该传感器用于布病病菌的分析。制作的电极无需对抗原或者抗体标记，制备相对简单，可为布病的快速检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

CHI760C电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；金纳米颗粒修饰丝网印刷碳电极（GNPs-SPE，DRP-110GNP型，西班牙DropSens公司）；恒温培养箱（PYX-DHS-50X65-BS-Ⅱ型，上海跃进医疗器械厂）。

布鲁氏菌病试管凝集试验抗原、布鲁氏菌标准阳性血清均购买于中国兽医药品监察所（北京，中国）。牛血清白蛋白（BSA，Roche 公司）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、亚铁氰化钾、氯化钾及氯化钠等试剂购买于天津江天统一试剂公司。布鲁氏菌抗原用磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered saline，PBS，10 mM，pH 7.4）稀释成浓度为4 × 105CFU/mL 的抗原液。布鲁氏菌标准阳性血清使用前用PBS进行25倍稀释。试验过程中所用水均为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

磷酸缓冲溶液（PBS，pH 7.4）的配制：KCl 7.43 g，Na2HPO43.58 g，KH2PO41.36 g，配成1 000 mL溶液。电解液的配制：2.5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6（体积比为1：1），0.1mol/L KCl，10 mmol/L PBS（pH 7.4）。

1.2 免疫传感器的制备

布鲁氏菌抗体通过滴涂法修饰到GNPs-SPE的工作电极表面，在37 ℃下培养1 h，待抗体被金纳米颗粒吸附到电极表面后，将电极浸入到PBS中，30 s后，用超纯水轻轻冲洗2次。在被覆抗体的电极表面滴加1%的牛血清白蛋白封闭液15 µL，37 ℃下放置1 h，以封闭电极表面未结合抗体的活性位点。之后电极浸入到PBS中30 s，用超纯水冲洗2次后备用。

1.3 试验方法

GNPs-SPE为一次性丝网印刷碳电极，具有强化的电子转移特性，放于室温干燥的封闭环境中。该电极将金纳米颗粒与碳混合固化到陶瓷基底上（33 mm×10 mm×0.5 mm）作为工作电极（直径4 mm），同时将碳固化到陶瓷上作为对电极，银作为参比电极。电化学工作站的三电极分别与GNPs-SPE的对应三组电极引线相连，构成电化学三电极测试系统。

在制备好的免疫传感器电极表面滴加一定浓度的布鲁氏菌溶液15 μL，37 ℃下孵化1 h后，分别用PBS和超纯水冲洗2次。在电极表面滴加50 μL电解液，以CV法考察电极表面不同修饰状态的电化学特性。CV法的测试条件：电压-0.4～0.6 V，扫描速度为100 mV/s，扫描间隔为1 mV。

2 结果与分析

2.1 电化学免疫传感器检测原理

在金纳米颗粒丝网印刷工作电极表面，利用纳米金比表面积大，吸附能力强、导电性强的优点，通过滴涂法自组装吸附上布鲁氏菌抗体；再利用1%的牛血清白蛋白封闭液封闭电极表面未结合抗体的活性位点，防止未结合抗体的金纳米颗粒与布病病菌结合，造成测量误差。最后通过抗体-抗原的特异性结合，将布鲁氏菌抗原捕获到电极表面。检测过程如图1所示。

在检测过程中，抗原-抗体复合物的形成将会增加其对电子传递的阻力，阻碍了[Fe（CN）6]3-/4-氧化还原对到电极表面的途径，导致电子传递阻抗增大。因此通过电化学测试，可以实现细菌的定性或定量检测。

2.2 电极修饰过程的表征

在CV测试中，伴随电极的修饰过程，电子传递速率会发生变化，从而导致不同状态下电极表面峰电流、峰电位间距会发生变化。其中，氧化峰电流值（pa）、氧化峰与还原峰电流比值的绝对值（|pa/pc|）及氧化峰与还原峰电位差值（Δp）是考察电极的重要特征参数。为进一步表征电极的修饰过程，以不同修饰状态的电极为工作电极，于2.5 mmol/L [Fe（CN）6]3-/4-溶液中-0.4～0.6 V的电位范围内进行循环伏安测定。图2是电极逐步修饰过程的循环伏安曲线。曲线a、b、c分别是裸电极、绑定抗体电极、BSA封闭后电极的循环伏安曲线。电极的特征参数如表1所示。

注：a为裸GNPs-SPE；b为抗体修饰后；c为封闭后；d为布鲁氏菌细胞（4×105CFU/ mL）吸附后

表1 修饰抗体后电极的特征参数

通过观察曲线a可以发现，在GNPs-SPE裸电极上有一对[Fe（CN）6]3-/4-的可逆氧化还原电流峰，峰电位pa为0.214 V，pc为0.073 V，|pa/pc|为1.03，接近1.00，表面电极具有较好的可逆性。当电极表面修饰有布鲁氏菌抗体后，响应电流降低（图2曲线b），表明[Fe（CN）6]3-/4-可以通过单分子层到达电极表面进行反应，但是由于电极上有不同物质，使得[Fe（CN）6]3-/4-向电极表面扩散的有效截面积减小，因此氧化电流氧化电流pa（73.03 μA）比裸电极（92.26 μA）明显减小，电位差Δp明显增大（从0.141 V增加到0.169 V）。当电极用BSA封闭后（曲线c），由于BSA封闭了未结合活性位点，峰电流稍有下降（从73.03 μA降到72.74 μA）和峰电位间距的稍有增加（从0.169 V增加到0.179 V）。当修饰好的电极表面滴加一定浓度的布鲁氏菌溶液15 μL（浓度为4×105CFU/mL），37 ℃下孵化1 h后，所得到的曲线如图2中的曲线d，由于抗原抗体的专一性免疫反应，生产的免疫复合物阻塞了修饰电极的更多孔径通道，从而增大了[Fe（CN）6]3-/4-电子转移阻力，同时有效截面积进一步减小，因此导致响应电流进一步下降。

2.3 试验条件的选择

研究发现，免疫传感器在20～500 V/s范围内，氧化还原峰的电流与速率呈线性关系。说明氧化还原探针[Fe（CN）6]3-/4-在免疫电极表面的电化学反应是表面控制过程[14]。后续设置扫描速度为100 mV/s。分别选择不同稀释倍数（10、25、250倍）的抗体绑定到电极上。经测定，25倍稀释抗体电极的氧化峰电流变化最大。所以，试验中选择抗体25倍稀释。另外，溶液的pH值会影响免疫反应，试验中病菌宜在生物体内相似的生存环境，即选择pH值7.4为工作的酸碱度[15]。

2.4 免疫传感器对布鲁氏菌抗原的电化学响应特性

将布鲁氏菌抗原（浓度为4 × 105CFU/mL）与抗体结合引起的氧化峰电流的变化值Δpa（pa（BSA）-pa（菌体结合））作为电流响应信号，PBS缓冲液为空白对照，电流响应结果如图3所示。抗原抗体免疫结合导致氧化峰电流减小，而无菌的PBS缓冲液电流值则几乎没有变化，说明免疫反应生成的免疫复合物进一步阻碍了电子传递。

同时，试验考察了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌对布鲁氏菌测定的干扰。分析过程中分别用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌代替布鲁氏菌进行检测，PBS缓冲液为对照。结果表明，该检测方法对布鲁氏菌的响应最大，干扰菌的响应信号与空白液相当，说明传感器对布鲁氏菌有较好的特异性。

3 结论

利用金纳米颗粒的比表面积大的特点，构建了一种金纳米颗粒修饰碳电极固载布鲁氏菌抗体免疫传感器。以氧化峰电流的变化值（Δpa）作为电流响应信号，免疫传感器对布鲁氏菌有较好的特异性。试验制备的免疫传感使用简单，而且样品测试量少（15 μL），检测周期短，有利于布病的早期诊断，具有很好的应用前景。

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Study on antibody immobilization biosensor ofwith gold nanoparticles-modified carbon electrode

Wu Haiyun1, Sun Xuemei2, Zeng Yanan1, Yu Yaping1, Yang Renjie1, Wei Yong1,Corresponding Author

（1. College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Nankai Xiangyu International School, Tianjin 300110, China）

An immunosensor fabricated by immobilizingantibody onto the surface of gold nanoparticles-modified screen-printed carbon electrodes（GNPs-SPCEs）was proposed for the rapid detection of. The gold nanoparticle carbon electrode was used as the working electrode, and theantibody was modified on the surface of the working electrode to construct the electrochemical three electrode system. The reaction process was characterized by cyclic voltammetry（CV）. The change value of oxidation peak current（Δ IPA）was used as the current response signal, and PBS buffer was used as blank control. It was found that when the antigen ofcombined with antibody, the oxidation peak current decreased, while the current value of sterile PBS buffer almost did not change. Whenandwere used to replace, the response signal of interfering bacteria was similar to that of blank solution. Therefore, the immunosensor has good specificity for.

; gold nanoparticles; immunosensor; cyclic voltammetry; electrochemistry

1008-5394（2021）04-0059-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.013

TP212.3；TP212.9

A

2020-11-15

天津市教委科研计划项目（2017KJ180）

吴海云（1985－），女，助理研究员，博士，主要从事生物传感器方面的研究。E-mail：haiyunwu2019@163.com。

卫勇（1973－），男，副教授，博士，主要从事智能农业技术与装备方面的研究。E-mail：weiytj@qq.com。

责任编辑：杨霞