透析法制备普鲁兰多糖纳米粒子的研究

许贤美，蔡锋隆，吴凤明，李留安，张建斌，通信作者

透析法制备普鲁兰多糖纳米粒子的研究

许贤美1，蔡锋隆2，吴凤明2，李留安1，张建斌1，通信作者

（1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392；2. 天津市广源畜禽养殖有限公司，天津 301824）

研究普鲁兰多糖羟基与邻苯二甲酸酐反应，使普鲁兰多糖分子基团收缩，应用透析法使普鲁兰多糖纳米化。试验结果表明：通过1H-NMR技术可判断糖基的构型、氢所在的化学位置，即普鲁兰多糖羟基与邻苯二甲酸酐已结合；结合后电镜扫描图可知其颗粒形态为圆形；1∶3、1∶6、1∶9、1∶12的纳米粒子大小的平均值分别为119.2、146.5、176.4和114.3 nm。

普鲁兰多糖；纳米粒子；透析法；扫描电子显微镜；核磁共振

天然多糖具有亲水、安全、稳定、无毒、生物可降解、自然界存在广泛、易制备和价格优等优点；同时，多糖分子链有较多不同种类的基团，经化学和生化方法修饰，可获得相应的功能化多糖衍生物[1-2]。因此，应用多糖及其衍生物作为药物载体的研究报告日益增多[3]。

普鲁兰糖（Pullulan）是由出芽短梗霉发酵产生的一种胞外多糖，又称普鲁兰多糖、短梗霉多糖、茁霉多糖等。BERNIER最先将普鲁兰糖分离并解析其结构[4]，后将其命名为“普鲁兰糖”[5]。普鲁兰多糖具有水溶性、无毒无害、黏度低、可塑性强、多羟基易化学修饰和缺少免疫原性等优 点[6-7]，由于这些独特的性质，逐渐被应用于纳米药物载体研究[8-9]，是一种具有极大应用开发价值和前景的多功能型生物制品[10]。

纳米粒子作为理想载体可运载抗体、药物，通过抗原—抗体免疫定向作用到靶向组织或器官。纳米粒子的小尺寸效应、可修饰性及结构组成的多样性，使其有可能在重大疾病的早期检测与诊断、肿瘤细胞特异性杀伤、病原体清除及修复等方面发挥重要作用[9]。工程化的纳米粒子甚至有可能进入人体的器官，甚至是单个细胞[11]。现如今多糖纳米粒子在心血管疾病治疗及抗癌药物制备中已取得相应的研究进展，应用前景广阔。而在畜牧业中可以趋向作用于特定的益生菌，如在不改变乳酸杆菌性质的前提下，疏水改性普鲁兰多糖能促使乳酸杆菌催化产生细菌素，增强抗菌性能[12]。

本试验邻苯二甲酸酐在催化剂作用下，与普鲁兰多糖分子中的羟基结合，使普鲁兰多糖分子基团收缩，形成纳米粒子。在不同剂量的邻苯二甲酸酐作用下形成大小不一的纳米粒子。将利用该方法制得的普鲁兰多糖纳米粒子添加到饲料中更为健康、安全。

1 材料及方法

1.1 材料及试剂

普鲁兰多糖（Pullulan，购自山东福瑞达生物科技公司）、邻苯二甲酸酐（Phthalic anhydride，PA，购自Sigma公司）、N-N二甲基甲酰胺（DMF，购自Sigma公司）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，购自Sigma公司）、氮气（购自天津市兴威气体有限公司）、无水乙醇（购自天津市风船化学试剂科技有限公司）。

1.2 仪器及设备

智能磁力搅拌电热套（河南爱博特科技发展有限公司）、滤膜（美国Spectra/Por透析膜）、冻干机（宁波新芝生物科技有限公司）、核磁共振仪、纳米粒度分析仪、电子显微镜。

1.3 操作步骤

1.3.1 普鲁兰多糖纳米粒子制备

本试验在普鲁兰多糖中分别添加4个不同比例邻苯二甲酸酐（1∶3、1∶6、1∶9、1∶12），筛选最适的添加比例。本试验参考HONG等的方法[12]。

试验步骤如下：

（1）用分析天平称取一定量的普鲁兰多糖加入用三口烧瓶装有的DMF溶液中溶解（每克多糖用10 mL DMF溶解），用加热套加热至54 ℃使普鲁兰多糖溶解。

（2）称取一定量DMAP溶于DMF溶液中（每mol普鲁兰多糖加0.1 mol DMAP做催化剂）。

（3）将（1）中的普鲁兰多糖溶解后，充入氮气10 min，将三口烧瓶内的空气排净，排净后，将（2）中的催化剂加入三口烧瓶中。

（4）在54 ℃充分反应48 h后，冷却，将冷却后的溶液倒入Spectra/Por透析膜中，并把装好液体的滤膜放至4 ℃蒸馏水中透析。

（5）透析24 h之后，用250 mL无水乙醇洗涤，去除未反应的疏水性基团，洗涤过夜。

（6）洗涤后，将滤包中的溶液转移至离心管，冷却干燥。

（7）干燥后，称量冻干物质的重量并溶解（按照每10 mg冻干物质用1 mL DMF溶解）。

（8）溶解完全后，移入滤膜中，再次放入预冷后的4 ℃蒸馏水中进行透析，24 h之后取出。

（9）水透析结束，将滤膜中的溶液冻干，即制得成品，呈泡沫状。

1.3.2 样品分析

本次试验样品检测采取方法为固体核磁共 振-H谱、电镜扫描形貌及纳米粒度测定。

2 结果与分析

2.1 核磁共振（1H-NMR）结果

对样品进行1H-NMR分析可知，普鲁兰纳米粒子糖基的构型、氢所在的化学位置以及这些氢的相对数量关系，根据邻苯二甲酸酐和普鲁兰多糖反应结合后制得的纳米粒子中不同基团的结合率，可知所得到的样品即是纳米粒子。

1∶3、1∶6、1∶9、1∶12核磁共振结果中均出现明显峰值如图1、图2所示，由此可以看出4个添加浓度均可使普鲁兰多糖纳米化。

2.2 电镜（SEM）结果

将1∶9制得的样品放大至50 000倍（图3）时，可看出其纳米粒子表征呈圆形且其中有大小不一的孔径；将1∶12制成样品放大至50 000倍（图4）可见纳米粒子表征为圆形，有孔径并且其直径明显小于1∶9。

由1∶3及1∶6浓度样品电镜检测结果图像也可看出，其直径明显较1∶9及1∶12浓度制得纳米粒子大。研究结果表明，随邻苯二甲酸酐添加量增多，制成的纳米粒子的疏水性增强。

2.3 纳米粒子粒度测定结果

通过图5可知，1∶3制得普鲁兰多糖纳米粒子大小为229.8 nm，所占比例为81.9%，平均大小为119.2 nm；1∶6制得普鲁兰多糖纳米粒子大小为190.1 nm，所占比例为94.3%，平均大小为146.5 nm；1∶9制得普鲁兰多糖纳米粒子大小为143.7 nm，所占比例的97.3%，平均大小为176.4 nm；1∶12制得普鲁兰多糖纳米粒子大小为124.8 nm，所占比例为98.5%，平均大小为114.3 nm。由此可知，1∶3和1∶6时杂质对其影响较大，使其均值与实际情况偏差较大，而1∶9及1∶12时制得的普鲁兰多糖纳米粒子大小均匀度比较高，1∶12时所制成的纳米粒子粒度大小最小，与其电镜检测结果相一致。试验研究表明，随着支链淀粉中共轭邻苯二甲酸基团数量增加，纳米粒子颗粒大小减小，且均匀度比较大。可知1∶12是较1∶3、1∶6及1∶9更适合该方法制备普鲁兰多糖纳米粒子的邻苯二甲酸酐的最佳比例。

3 结论

本试验利用邻苯二甲酸酐与普鲁兰多糖反应使普鲁兰多糖分子基团收缩的方法形成普鲁兰纳米粒子。制成的样品经1H-NMR分析可知，邻苯二甲酸酐与普鲁兰多糖结合，且成功合成所需普鲁兰多糖纳米粒子；经SEM扫描可知粒子的表征为圆形，分布较均匀；DLS测定结果精确比较出各浓度之间的差异，所添加的4个邻苯二甲酸酐浓度梯度均可制出成功的普鲁兰多糖纳米粒子，最适浓度比例为1∶12。

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Study on the preparation of pullulan polysaccharide nanoparticles by dialysis

Xu Xianmei1, Cai Fenglong2, Wu Fengming2, Li Liuan1, Zhang Jianbin1,Corresponding Author

（1. Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Guangyuan Livestock and Poultry Breeding Co., Ltd., Tianjin 301824, China）

The purpose of this experiment was to study the reaction of pullulan polysaccharide hydroxyl with phthalic anhydride, and to shrink the molecular group of pullulan polysaccharide by dialysis. The results showed that the configuration of the sugar group and the chemical position of the hydrogen could be determined by1H-NMR; That is, the pullulan polysaccharide hydroxyl group had been combined with phthalic anhydride. According to the SEM, the particle shape was round. The mean particle sizes of 1∶3, 1∶6, 1∶9, 1∶12 were 119.2 nm, 146.5 nm, 176.4 nm and 114.3 nm, respectively.

pullulan polysaccharide; nanoparticles; water dialysis; sweep electron microscope（SEM）; nuclear magnetic resonance（NMR）

1008-5394（2021）04-0023-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.006

S828

A

2020-04-07

天津市级大学生创新创业训练计划项目资助（201810061104）；天津市生猪产业技术体系创新团队（ITTPRS2021006）；天津市“131”创新型人才团队建设项目（20180318）；天津市科技重大专项与工程项目（18ZXBFNC00310）

许贤美（1998—），男，本科在读，研究方向：动物科学。E-mail：1710472604@qq.com。

张建斌（1976—），男，副教授，博士，研究方向：畜禽健康养殖。E-mail：zjbzwz@126.com。

责任编辑：张爱婷