植物油基金属加工液中的生物抑菌技术研究*

程慧杰 赵朋飞 李小磊,3 戴媛静,3

(1.清华大学天津高端装备研究院润滑技术研究所 天津 300300；2.季华实验室广东佛山 528200;3.清华大学摩擦学国家重点实验室 北京 100084)

金属加工液是指在金属加工过程中起到冷却、润滑、防锈、清洗等作用的液体，通常由矿物油、植物油或合成油等基础油和少量的多种添加剂组成[1-2]。随着我国制造业的蓬勃发展，金属切削液使用的范围也愈发广泛，目前矿物油作为金属加工液基础油的用量最大。但是，矿物油不仅自身生物降解性差，废液中油液在水体中会形成油膜，致使水体中的动植物生存受到威胁，造成水体和环境污染等问题；并且还存在废液难处理、委外费用高昂等问题；另外矿物油属于不可再生的石油资源，发展前景受到限制[3-4]。植物油具有润滑性能好、黏度指数高、挥发度低、安全无毒等特点，同时具有原料来源广泛易得、资源丰富、可再生可降解等优点，被认为是矿物油的优良替代品[5-6]。采用植物油替代矿物油，从源头解决其生产成本高、环保性差等问题，是近年来金属加工液的重要发展方向。近些年来，诸多以植物油为基础油的金属加工液产品相继问世，比如巴索的Vasco1000、好富顿的M-22、科润的KR-C8822等。但植物油易被活性微生物降解，使其乳化液易被微生物侵染，从而引发腐败，导致植物油基金属加工液的润滑性能下降、寿命缩短[7]。由于金属加工液使用工况是一个开放式的供给-回流循环模式，外界污染源可通过多种途径进入系统，比如稀释的自来水、空气中灰尘、操作工人接触引入的杂质以及液槽管道底泥残留物等。此外，在金属加工液实际使用工况中，微生物侵入也是不可避免的。

目前防止切削液变质最有效的方法就是加入化学杀菌剂，通过化学方法抑制细菌滋生，增加切削液的使用周期[8]。杀菌剂的种类有很多，但它们的作用机制大多是通过破坏细菌、真菌的细胞壁与细胞膜，使细胞内含物外流，起到杀菌作用[9]，但杀菌剂不可避免地会对人体和环境产生危害，比如最常见的是引起操作人员皮肤过敏，并且化学杀菌剂长久使用会因微生物产生抗性而失去效果[10]。并且，在化学杀菌剂失效之后，乳化液中的有机物成分为微生物提供了必要的营养物质，从而使微生物大量生长繁殖，在此过程中伴随金属加工液的有效成分油性剂、乳化剂、缓冲剂等被降解，破坏了乳化液的油水平衡、影响其运动黏度，造成乳化液稳定性下降、pH值下降，加快金属在乳化液中的腐蚀[11]。近年来，生物技术在各行各业中广泛应用，生物技术本身具有成本低、效率高、能耗低、无污染等优点，相较于化学杀菌剂，生物抑菌在环保性和经济性方面具有更加显著的优势，选择生物抑菌是行之有效且对人体及环境友好的腐败控制技术。

针对植物油基金属加工液的腐败控制问题，本文作者突破常规的化学抑菌方法，提出了一种全新的以菌抑菌的生物控制腐败技术。首先从在用金属加工液体系中提取了一株优势菌——铜绿假单胞菌Y1，研究了其生长特性；然后将其添加到植物油基金属加工液的乳化液中，探索其抑菌效果；最后建立可用生物抑菌工艺，以期达到减少使用甚至不使用化学杀菌剂的目的，为实现绿色环保型植物油基金属加工液的设计提供基础理论支撑和技术支持。

1 试验部分

1.1 材料与仪器

金属加工液：植物油基钛合金加工液1000Ti由清华大学天津高端装备研究院润滑技术研究所研制，天津清润博润滑科技有限公司生产；1000Ti腐败液为某机械制造厂现场使用1年后的金属加工液。

菌株：优势菌为铜绿假单胞菌Y1，为实验室提取；腐败菌F1 (棉子糖肠球菌)，分离自1000Ti腐败液；腐败菌F2 (摩根菌)，分离自1000Ti腐败液；腐败菌F3 (解淀粉芽孢杆菌)，分离自1000Ti腐败液。

LB液体培养基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl，1 L蒸馏水，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

基础培养基：5 g葡萄糖、2 g(NH4)SO4、1 g柠檬酸钠、0.2 g MgSO4·7H2O、0.4 g K2HPO4、0.6 g KH2PO4，1 L蒸馏水，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

杀菌剂：试验选用金属加工液配方常用杀菌剂，具体种类和成分如表1所示。

表1 杀菌剂种类及有效成分

仪器：UV-1800PC型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司生产；HH-4型数显电子恒温水浴锅，常州国华电器有限公司生产；LS-35LD型立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司生产；THZ-98C型恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司生产；SW-CJ-1D型单人单面垂直净化工作台，苏州博莱尔净化设备有限公司生产；JJ1000型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂生产；VPWRLC-250G型纯水制备机，南方泵业股份有限公司生产。

1.2 试验方法

为了系统地研究Y1的生长特性，分别以温度、基础培养基的pH值、常用杀菌剂、不同营养成分为单一变量，在基础培养基中监测Y1的生长情况。试验选取的控制温度分别为25、30、35、40、45 ℃，控制基础培养基的pH值分别为4、5、6、7、8、9、10、11；选取的常用金属加工液杀菌剂为MBM、WSplus、IPBC、SPT等；试验时将基础培养基的碳源和氮源换成1000Ti的原料。利用紫外分光光度计于波长600 nm处测定以上菌株培养液的吸光度，以OD600值表示生长情况(OD600值与生长量成正比)。

为了验证Y1抑制杂菌的效果，分别设计了混菌共培养试验、强制腐败试验和实际应用现场模拟试验。混菌共培养试验是将Y1与1000Ti腐败菌混合一同培养；强制腐败试验是通过添加腐败液进行试验，杀菌剂按表2中比例添加；实际应用现场模拟试验(模拟加工液在数控机床液槽里的工作状态)按表3中Y1及杀菌剂比例进行试验。在实际应用现场模拟试验中，分析了Y1对金属加工液pH值、防锈性能和润滑性能的影响。

表2 强制腐败试验不同添加剂组合

表3 现场模拟试验不同添加剂组合

1.3 微生物

优势菌Y1、腐败菌F1、腐败菌F2、腐败菌F3的菌种信息见表4，菌落形态如图1所示。

表4 菌种基本信息

图1 菌种的菌落形态Fig 1 The colony morphology of the strain(a)Y1;(b)F1;(c)F2;(d)F3

2 结果及讨论

2.1 铜绿假单胞菌Y1的生长特性

2.1.1 Y1的生长曲线

将Y1培养液以1%的接种量接入盛有100 mL基础培养基的250 mL锥形瓶中，置恒温振荡器中，在36 ℃、120 r/min条件下培养，在不同时间节点下取出培养液测定OD600值，得到Y1的生长曲线如图2所示。

图2 Y1的生长曲线Fig 2 The growth curve of Y1

Y1的生长曲线可分为4个阶段。第一个阶段为延迟期，在接种初期0～2 h内，菌体的生长极为缓慢，速率基本为0。因菌体接种初期，其代谢系统需要适应新的环境，同时产生合成酶、辅酶、其他代谢中间产物等，所以此时期的细胞数目保持相对稳定。Y1的生长延迟期很短，2 h后即进入第二阶段，即增殖期。经过延迟期的准备，菌体生长拥有了足够的物质基础，同时已适应外界环境，故菌体繁殖旺盛，生长速率快，生长量快速增加。到增殖期中后期时，细胞生长迅速，且活性高，此时段的菌体适合作为种子液，用作后续试验。

第三阶段为稳定期。在12～22 h内活菌数保持相对平衡，总菌数达到最高水平，细胞代谢产物积累达到顶峰。营养物质在此时期的消耗，导致碳氮比例失调，有害代谢产物积累，pH值等理化条件不再适宜，菌体生长受到抑制。

第四阶段为衰亡期。22 h后，菌体死亡速度大于新生成的速度，整个群体出现负增长。因为有害代谢物的过度积累，环境中的营养成分不足，不能够维持菌体正常的代谢活动，所以细胞的分解代谢大于合成代谢，大量菌体消亡。

2.1.2 温度、pH对Y1生长的影响

基础培养基接入1%的Y1种子液，分别置于25、30、35、40、45 ℃的恒温振荡器中于120 r/min下培养48 h；另外以同样接种量接入pH值分别为4、5、6、7、8、9、10、11的基础培养基中，36 ℃、120 r/min条件下培养48 h，测定培养液的OD600值。

Y1在不同温度下的生长情况如图3(a)所示，Y1适宜生长温度的范围较宽，在20～45 ℃条件下皆可生长，且随着温度的升高，OD600值呈现先增加后下降的趋势。其中，在30～35 ℃条件下，OD600值较高，说明此温度范围有利于菌体的生长，Y1的最适生长温度为35 ℃。随着温度的上升，菌体中的生物化学反应速率和生长速率加快，但同时伴随着菌体的重要组成如蛋白质、核酸等随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏[12]。因此，只有在一定温度范围下，菌体的代谢活动与生长繁殖才随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，就会对菌体产生不利影响，导致其功能急剧下降以至死亡。因此，随着温度的升高，生长量先增加后减小。

图3 温度和pH值对Y1生长的影响Fig 3 Effect of temperature (a) and pH value(b) on the growth of Y1

图3(b)为不同pH值条件下Y1的OD600值，随着培养基pH值的升高，OD600值呈现先升高后降低的趋势，pH值在5～10范围内Y1均能生长，最适宜Y1生长的pH值为7。pH过高或过低会使菌体内蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，影响其生物活性，甚至导致微生物变性失活，还可能引起细胞膜电荷变化，影响细胞对营养物质的吸收[13]。

2.1.3 杀菌剂对Y1生长的影响

将Y1种子液以1%的接种量分别接入添加不同杀菌剂的基础培养基中，在恒温振荡器中于36 ℃、120 r/min条件下培养48 h，测定培养液的OD600值，培养前后差值表示增长量，结果如表5所示。

表5 单一杀菌剂对Y1生长的影响

由表5可知，Y1对BK、MBM、WSplus、M-701、M-789、M-BBF、NEUF652、OK、IPBC、SPT等几种杀菌剂具有一定耐受性，Y1可以在这几种杀菌剂存在下生长繁殖。考虑到与1000Ti体系的适配性，选择将BK、MBM、WSplus、IPBC、SPT 5种杀菌剂在培养基中的相对添加量增大，考察其对Y1生长的影响，其结果如表6所示。

表6 5种杀菌剂质量分数对Y1生长的影响

由表6可以看出，当杀菌剂BK、SPT的质量分数分别提高到0.125%和0.05%时，Y1的生长繁殖受到强烈抑制作用；当MBM、WSplus、IPBC质量分数提高到加工液的参考用量(0.175%)时，Y1生长繁殖情况依然良好，说明Y1对这3类杀菌剂具有一定的耐受性。

根据以上单一杀菌剂对Y1生长的影响，选择添加不同量(具体见表7)的杀菌剂组合到基础培养基，接种1%的Y1种子液，在36 ℃、120 r/min的摇床条件下培养48 h，以不接菌的培养基为对照，测定培养液的OD600值，其结果如表7所示。

表7 组合杀菌剂对Y1生长的影响

由表7可知，在不同杀菌剂组合情况下，Y1均能生长繁殖；在MBM(0.15%)+SPT(0.375%)和WSplus(0.15%)+IPBC(0.05%)2种杀菌剂组合情况下，假单胞菌Y1的增长量较低。

综合以上结果可知，Y1对一定质量分数的BK、MBM、WSplus、M-701、M-789、M-BBF、NEUF652、OK、IPBC、SPT等单一杀菌剂及一定质量分数的MBM+SPT、WSplus+IPBC杀菌剂组合具有耐受性。

2.1.4 不同营养成分对Y1生长的影响

金属加工液常使用环烷基橡胶油(矿物油)、白油(矿物油)、菜籽油(植物油)、妥尔油(植物油)、3955 (自乳化脂)、C103 (铝缓蚀剂)、硼酸酯(防锈剂)、二甘醇胺(pH值调节剂)、三乙醇胺(碱值储备剂)作为配方原料。分别利用这些物质代替基础培养基中的碳源、氮源，然后按1%的接种量接种Y1种子液与1000Ti腐败液，放置于恒温振荡器中在36 ℃、120 r/min条件下培养48 h。测定培养液的OD600值变化量，其结果见表8。

表8 营养成分对Y1生长的影响

Y1及腐败菌大量繁殖消耗，主要集中在菜籽油、妥尔油和3955 (自乳化脂)3种物质。这3种物质均为植物油，植物油易被微生物分解代谢，可作为微生物生长繁殖的优质营养物质。从Y1相对腐败菌增长量可以看出，在这3种原料作为碳源的情况下，Y1增长量高于腐败菌增长量，具有营养物质竞争优势。此外，菜籽油、妥尔油和3955 (自乳化脂)均是金属加工液1000Ti的主要成分，可以推测Y1在1000Ti体系中可以取得生长优势，从而抑制其他腐败菌的生长繁殖。

2.2 混菌共培养试验中Y1的抑菌效果

在液态LB培养基中，将Y1与腐败菌等量(质量分数1%)进行混合培养，并以腐败菌(质量分数1%)单独培养作参比，培养条件为36 ℃、120 r/min，考察假单胞菌Y1对腐败菌的抑制作用，其结果如图4所示。Y1与腐败菌F1、F2、F3共培养时，仅发现Y1的菌落，说明Y1能够取得绝对的生长优势。其原因应包含2个方面：(1) Y1的抗生作用。即Y1代谢过程中可能产生了能够抑制腐败菌生长繁殖的抑菌物质，这类物质在低质量分数下就能对非他类微生物的生长和代谢起到抑制作用，导致其他微生物出现原生质凝聚、菌丝体扭曲、细胞发生自溶而死亡；(2) Y1的营养和空间竞争作用。在同一环境中的2种或者2种以上的微生物个体之间，对生存空间、营养物质、氧气等抢占形成竞争关系，Y1相对腐败菌具有营养和空间竞争优势，导致腐败菌无法正常繁殖代谢[14-17]。

图4 培养基中接种不同微生物时的生长情况Fig 4 Growth of different microorganisms inoculated in the medium(a)Y1+F1;(b)Y1+F2;(c)Y1+F3;(d)F1;(e)F2;(f)F3

2.3 强制腐败试验中Y1的抑菌效果

将金属加工液1000Ti (无杀菌剂)用水稀释至5%质量分数，按表2添加不同量的Y1、腐败液(含有大量的腐败菌F1、F2和F3)和杀菌剂WSplus (1000Ti配方中WSplus的质量分数为3%，稀释后为0.15%)，然后置于30 ℃水浴中，每天曝气8 h，定期取样检测微生物繁殖生长情况，考察Y1在强制腐败条件下的抑菌效果[18-22]。

由表9可知，若在无杀菌剂的1000Ti中单独添加质量分数1.5%的Y1，从第7天开始，1000Ti中仅生长Y1，其占据完全生长优势；若在无杀菌剂的1000Ti中添加质量分数1.5% Y1的同时加入质量分数0.5%的腐败液，1000Ti中Y1从第14天开始占据生长优势；若在无杀菌剂的1000Ti中添加质量分数1.5%的Y1和质量分数0.5%的腐败液，同时加入质量分数0.05%的杀菌剂WSplus，1000Ti中Y1从第14天开始占据完全生长优势；当配合加入杀菌剂WSplus的质量分数为0.075%或0.1%时，1000Ti中Y1从第7天开始占据完全生长优势。

表9 不同时间内微生物生长情况

总体而言，在金属加工液1000Ti中添加腐败液进行强制腐败试验的条件下，Y1可以逐渐取得生长优势，直至完全占据生长优势。这可能是由于Y1产生了某些抗菌物质，导致腐败菌死亡；或者是由于Y1相对腐败菌在营养物和生存空间竞争上具有优势，致使腐败菌繁殖代谢受到抑制。另外，由于Y1对杀菌剂WSplus具有耐受性，然而腐败菌对WSplus无耐受性，所以当WSplus添加量增大时，Y1能在更短时间内取得生长优势。目前1000Ti配方中杀菌剂WSplus的质量分数为3%，稀释后为0.15%，从试验结果可以看出，利用Y1可以实现在该体系中不使用或者少使用杀菌剂的情况下完全抑制该体系中腐败菌的生长。

2.4 现场模拟试验中Y1的抑菌效果

将金属加工液1000Ti (无杀菌剂)用水稀释至5%质量分数，按表3添加不同量的Y1、杀菌剂WSplus，置于30 ℃水浴，每天曝气8 h，除了检验Y1的抑菌效果外，还重点分析了Y1的加入对金属加工液pH值、防锈性能和润滑性能的影响。

2.4.1 Y1对微生物的影响

由表10可知，若在无杀菌剂的1000Ti中未添加Y1和WSplus，1000Ti中仅生长腐败菌，腐败菌数量随时间逐渐增多；若在无杀菌剂的1000Ti中添加质量分数0.15%的WSplus，1000Ti中未生长腐败菌；若在无杀菌剂的1000Ti中添加Y1，由于Y1可能分泌抗菌物质或者争抢营养物质和生存空间，1000Ti中Y1从第14天开始占据生长优势。另外，由于Y1对杀菌剂WSplus具有耐受性，而腐败菌对WSplus无耐受性，所以当WSplus添加量增大时，Y1菌数增多。

表10 不同时间内微生物生长情况

2.4.2 Y1对pH值的影响

金属加工液在使用过程中，腐败菌的生长会分解其中的碱值储备剂，且腐败菌的代谢产物一般呈酸性，致使金属加工液的pH值不断下降[23]。另一方面，中性pH值的金属加工液中腐败菌更容易滋生，所以金属加工液在使用过程中一般需要维持其pH值≥8.5，以此防止腐败发生。由图5可知，在1000Ti中加入Y1的第3天，其pH值有所下降，其后进入稳定区，一直到第56天，pH值一直维持在9.0以上，说明Y1的加入未对该金属加工液的pH值产生影响。未添加Y1或WSplus的金属加工液pH值从第28天开始持续下降，pH值的降低原因可能为大量腐败菌的滋生会产生呈酸性的代谢产物。Y1或WSplus的加入，均可抑制腐败菌的滋生，从而保证金属加工液的pH值长时间维持稳定。

图5 不同时间内Y1对1000Ti pH值的影响Fig 5 The effect of Y1 on pH value of 1000Ti at different time

2.4.3 Y1对防锈性能的影响

取滤纸放入培养皿中，称取铸铁屑2 g，分别移取不同时间待测液2 mL，使所有铁屑润湿，盖上培养皿，在28 ℃放置2 h，除去铸铁屑，用自来水冲洗，观察锈蚀情况[24]。

腐败菌可代谢产生有机酸等酸性物质，容易引起金属锈蚀，同时腐败菌的滋生会分解消耗防锈剂，进而降低金属加工液的防锈性能。由表11可见，试验时间持续至第56天，Y1都没有影响1000Ti的防锈性能，一直处于最高防锈等级。Y1可能未分解1000Ti中起防锈作用的组分或分解量极低，不足以影响其性能，而且Y1又能抑制腐败菌生长，避免了腐败菌消耗防锈剂以及产生酸性物质致使防锈性能降低。未添加Y1和WSplus的1000Ti中生长繁殖了大量腐败菌，在42天后防锈性能等级下降。

表11 不同时间内Y1对1000Ti防锈性能的影响

2.4.4 Y1对润滑性能的影响

以Microtap攻丝扭矩仪测试金属加工液的成形润滑性[25]。测试条件：测试块为TC4钛合金；转速为500 rad/min；攻丝深度为20 mm；孔径为3.7 mm；刀具为挤压丝锥。

由表12可知，与对照组相比，4组试验组的攻丝扭矩分别提高5.39%、4.70%、0.70%、1.04%。可见对于金属加工液1000Ti，Y1的加入对其润滑性能的影响较小。1000Ti的主要润滑物质为植物油，Y1的生长繁殖虽然会消耗掉一部分植物油，但其生长可以抑制腐败菌对植物油的消耗，对比整体而言植物油的消耗量跟添加0.15%WSplus的1000Ti(实际使用过程中的金属加工液配方)相当，即Y1的加入不会影响1000Ti的润滑性能。

表12 Y1对1000Ti润滑性的影响(第56天)

综上所述，Y1可以作为一种优势菌添加到金属加工液1000Ti中，能够在保证金属加工液各项主要性能的基础上实现良好的抑菌效果，是一种可行的以菌抑菌技术。

3 结论

为了尽可能减少植物油基金属加工液中化学杀菌剂的使用，寻找生物以菌抑菌的方法，首先对Y1的生长特性进行研究，然后分析了不同试验条件下Y1的抑菌效果，得到了以下3点主要结论：

(1)铜绿假单胞菌Y1的最适生长条件：温度为40 ℃，pH值为6.0；Y1对BK、WSplus等单一杀菌剂及WSplus+IPBC等组合杀菌剂均具有耐受性。

(2)在混菌共培养试验、强制腐败试验中，Y1均表现出良好的抑菌效果，能够较好抑制1000Ti中主要腐败菌F1、F2和F3的滋生，并且配合极少量杀菌剂使用时，其抑菌效果更佳。

(3)在实际应用现场模拟试验中，Y1同样具有良好的抑菌效果，并且对金属加工液的pH值、防锈性能和润滑性能均无不良影响，可以保证56天内的金属加工液乳液运行性能稳定，证实了生物抑菌技术的可行性和良好效果。