不同活菌数卡介苗制品诱导免疫反应差异的比较

杨阳 ，付丽丽 ，赵爱华 ，徐苗

1. 沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016；2. 中国食品药品检定研究院，北京 102629

卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）是世界上最古老，使用最广泛的疫苗之一，主要用于结核病（tuberculosis，TB）的预防［1-3］。BCG 接种机体后，可刺激免疫系统产生特异性细胞免疫，使机体获得对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的免疫能力［4-6］。效力评价是疫苗质量控制的关键指标之一，目前，BCG 效力评价方法为BCG 诱导的变态反应法，根据动物对BCG 纯蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）反应大小进行评判［7］。

活菌数是皮内注射用BCG 重要的质控指标之一［8-10］，活菌数与疫苗效力相关。本研究对活菌数的差异能否引起PPD 反应大小的变化和BCG 诱导的细胞免疫反应水平的差异进行分析，以探索新的BCG 效力评价方法。

1 材料与方法

1. 1 疫苗 皮内注射用BCG 均为国内企业生产，规格为 0. 25 mg ／ 支，每支 5 人份，批号分别为：201504a034、201507a052、201507a037、201503a024、201507a059。

1. 2 实验动物 SPF 级豚鼠（同一性别，体重300 ～400 g）和 SPF 级 BALB ／c 小鼠（雌性，6 ～ 8 周龄，体重18 ～22 g）均由中国食品药品检定研究院实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（京）2017-0013。本实验对实验动物的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照《关于善待实验动物的指导性意见》（国科发财字［2006］398 号）相关规定进行。

1. 3 主要试剂 皮试用BCG-PPD：卡介菌纯蛋白衍生物国家参考品（批号：230015-201501）和卡介苗活菌数检测用参考品（以下称参考苗）由中国食品药品检定研究院制备；BCG 培养早期滤液蛋白由中国食品药品检定研究院结核室制备，批号：2016-0114；小鼠IFNγ ELISPOT 试剂盒购自瑞典Mabtech 公司；RPMI1640 培养基购自美国 Hyclone 公司；ConA 购自美国Sigma 公司。

1. 4 不同活菌数BCG 对PPD 反应影响的检测 将豚鼠随机分为6 组：5 个不同批号BCG 组和参考苗组，每组4 只。将BCG 用5 mL 生理盐水复溶，经豚鼠腹股沟皮下免疫，0. 5 mL ／ 只。免疫 5 周后，经豚鼠背部脊柱两侧皮内注射BCG-PPD，0. 2 mL ／ 只，24 h 后检测PPD 反应直径大小。

1. 5 不同活菌数BCG 对小鼠脾淋巴细胞抗原特异性IFNγ 水平影响的检测 将BALB ／ c 小鼠随机分为6 组：5 个不同批号BCG 组和参考苗组，每组5 只。将BCG 用2. 5 mL 生理盐水复溶，经小鼠头背部皮内免疫，0. 5 mL ／ 只（即 1 ／ 5 人份），对照组注射等体积生理盐水。分别于免疫后4、5 周，将小鼠脱颈处死，分离脾淋巴细胞，采用酶联免疫斑点法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）测定淋巴细胞分泌抗原特异性IFNγ 的水平。调整细胞浓度为 2. 5 × 106个 ／ mL，加至已包被 IFNγ 抗体的96 孔板中，100 μL ／ 孔，再加入卡介苗培养早期滤液蛋白（终浓度 2 μg ／ mL）刺激物，50 μL ／ 孔，另设RPMI1640 培养基作为阴性对照，ConA（终浓度为1 μg ／ mL）作为阳性对照，每个样本均设 2 个复孔，于37 ℃，5% CO2条件下培养 48 h 后，按照 ELISPOT试剂盒说明书操作，检测IFNγ 斑点形成细胞数（spot forming cells，SFCs）。

1. 6 统计学分析 应用SPSS 26 软件进行统计学分析，组间差异比较采用单因素方差分析，以P < 0. 05为差异有统计学意义；相关性分析采用Pearson 法，应用GraphPad Prism 8 软件作图。

2 结 果

2. 1 不同活菌数BCG 对PPD 反应的影响 BCG 活菌数在（1. 5 ～ 4. 6）× 106CFU ／ mg 范围内，其活菌数差异与诱导的皮肤变态反应并无规律的变化，BCG 活菌数与PPD 反应大小无相关性（F = 0. 820，P =0. 416），相关系数为0. 170。见图1 和表1。

图1 PPD 反应大小与BCG 活菌数的相关性Fig. 1 The relationship between PPD reaction levels and viable bacteria counts in BCG

2. 2 不同活菌数BCG 对小鼠脾淋巴细胞抗原特异性IFNγ 水平的影响 各批次BCG 免疫后4 周的SFCs-IFNγ 均小于免疫后 5 周；SFCs-IFNγ 与活菌数呈正相关（F 分别为 60. 757 和 26. 289，P 分别为0. 001 和 0. 007），相关系数分别为 0. 969 和 0. 932，且两个评价时间点趋势一致。见图2 和表1。

表1 不同BCG 制品PPD 反应平均直径及免疫后小鼠脾淋巴细胞IFNγ 的SFCsTab. 1 The average diameter of PPD reaction of different BCG products and the SFCs of IFNγ from murine spleen lymphocytes after BCG immunization with different numbers of viable bacteria

图2 小鼠脾淋巴细胞抗原特异性IFNγ 的SFCs 与BCG活菌数的相关性Fig. 2 The correlation between SFCs of IFNγ from murine spleen lymphocytes and viable bacteria numbers in BCG

3 讨 论

BCG 作为唯一预防TB 的疫苗至今已应用百年，在世界各国的TB 防治中发挥了重要作用，也是我国计划免疫疫苗中新生儿接种的第1 针。目前我国BCG 效力评价采用的是BCG 诱导的变态反应方法，根据动物对PPD 反应大小对结果进行评判［7］。本研究针对菌液浓度一致的条件，对BCG 活菌含量不同的制品进行了活菌数与PPD 反应大小的相关性分析，结果显示，在活菌数为（1. 5 ～4. 6）×106CFU ／ mg 范围内未发现明确的量效关系，表明在此范围内结核菌素试验不能体现活菌数差异给机体带来的反应差异。受限于样本来源，本研究只对活菌数在（1. 5 ～ 4. 6）× 106CFU ／ mg 范围内的样品进行了比较，其他活菌数范围内的制品也许会引起不同的PPD 反应，尚需进行更大范围的研究才能确认PPD 反应与活菌数之间的关系。

考虑到以上可能出现的现象，本研究同步进行了抗原特异性的IFNγ 水平检测。IFN 是体内细胞因子调节网络的重要组成部分，也是评价机体免疫反应的重要指标［11-15］。其中，IFNγ 是机体抗感染的主要免疫因子。机体初次感染会诱导广泛的IFNγ转录因子上调，促进IFNγ 的产生，进而诱导辅助性T 细胞向Th1 方向极化，Th1 细胞可产生多种细胞因子从而激活巨噬细胞，将被感染的细胞清除。因此，本研究以小鼠脾淋巴细胞特异性IFNγ 的SFCs作为小鼠抗原特异性的细胞免疫反应水平的评价指标，同时对不同活菌数BCG 诱导的细胞免疫程度进行相关性分析。实验结果表明，抗原特异性的IFNγ分泌量与BCG 活菌数呈正相关，即BCG 制品诱导的细胞免疫反应水平随活菌数增多而上升。

综上所述，本研究证实了BCG 活菌数与其诱导的细胞免疫水平具有相关性，与传统的PPD 试验相比，本研究采用的ELISPOT 法可更精确地评价BCG的效力，但细胞实验对试验设备、试剂、耗材及时间等要求高于传统的PPD 实验。因此，两种方法的优劣与质控适应性之间的权衡尚需进一步探讨。