不同抗凝剂对犬血细胞分析的影响

殷勤凯，马志强，于晶凤，刘学龙

1.延吉市小营镇综合服务中心，吉林延吉 133000；2.延吉市畜牧站，吉林延吉 133000；3.延吉市动物卫生检疫站，吉林延吉 133000；4.延边大学农学院，吉林延吉 133000

随着现代医疗技术进步发展，全血细胞分析仪得到广泛应用，血常规检查方便许多，其优点在于采血量少、分析项目多、分析时间短、准确率高等[1]。由于EDTA-K2的造价比较高，因此用EDTA-Na2代替做此次血细胞分析检测的抗凝剂，但注意EDTA-Na2溶解性能差，混合时间应适当延长[2]。它对血液中的钙离子有较好的结合能力，经过膜离子通道进入PLT膜内。由于EDTA-Na2螫合作用强于拘椽酸钠络合钙离子，因此EDTA-Na2对防止血液中PLT因各种因素而发生凝集有一定的作用，并对PLT计数影响较小，稳定性较好。

血常规检验过程中易发生各种错误，检测时要注意采集的血液为静脉血；检查前一天晚上，禁止给犬饲喂任何食物；血液与抗凝剂的比例适当；血液的稀释达到符合试验的标准；血液在2～8 ℃可保存24 h。

1 材料与试剂

1.1 样本

延边大学动物医院实验犬，静脉抗凝血，共10份。

1.2 试剂

RBC稀释液、1%盐酸溶液、复方尿素稀释液、0.1 mol/L盐酸溶液、淋巴细胞分离液等。

1.3 仪器

改良纽巴氏计数板、显微镜、计数器、高速离心机、动物血液分析仪等。

2 方法

2.1 检测方法

分析不同抗凝剂对血液成分中六项参数结果的影响，以EDTA-K2抗凝计数结果为对照，进行统计学分析。

2.2 红细胞计数

取一支小试管，用吸管吸3.98 mL红细胞稀释液，加入试管中。

用血红蛋白吸管吸取20 µL血样，然后将其插入盛有稀释液的试管底部，吹出血液，吸吹数次，最后试管口加塞，颠倒混合数次，即得200倍的稀释血液。

充液。取洁净的计数板和血盖片，将血盖片放在计数板的计数室上。用吸管吸取少量已稀释好的血液，以45°角置于计数板与血盖片交界的边缘，使血液扩散入计数室内。

计数。充室后静止3 min，用低倍镜计数红细胞。

2.3 白细胞计数

试管稀释法：用血红蛋白吸管吸取被检血至20 mm3处，插入到装有0.38 mL白细胞稀释液试管的底部，反复吹出血液，以洗净管内附着的白细胞，充分混匀，即得20倍的稀释血液。

充液。同红细胞计数法。

计数。与红细胞计数类似，不同的是将计数室四角上的四个大方格内的白细胞依次全部计数完。

2.4 血小板计数

取稀释液0.38 mL置于小试管中。

用血红蛋白吸管吸取20 mm3加有抗凝剂的新鲜静脉血，吹入试管，充分混匀。静置20 min，使红细胞溶解。

充入。用毛细吸管吸取上述稀释好的血液，充入计数室内。静置10～20 min，用高倍镜观察。

计数。高倍镜下精确计数红细胞计数区的血小板数。

2.5 血红蛋白测定

往测定管内加入0.1 mol/L盐酸至“20”刻度处。

用血红蛋白吸管吸取20 µL血液，用纱布拭去管壁外及管尖黏附的血液，插入装有盐酸的试管底部，吹入试管，反复吸吹数次，轻轻摇晃，充分混匀，静置5～10 mim，使其充分的酸化。

沿着管壁加入蒸馏水，稀释至与标准比色板颜色相同时为止，读取测定管内液柱凹面的刻度值，即读取血红蛋白的百分数或克数。

2.6 动物血液分析

按照仪器操作方法对抗凝血进行分析。

3 结果

3.1 检测结果

不同抗凝剂的血细胞测定结果见表1。

表1 不同抗凝剂血细胞参数测定结果统计值

从表1可知，采血抗凝后直接行血细胞检验，经t检验分析：WBC计数、RBC计数、Hb、HCT此4项参数在3种抗凝剂组间无显著性差异（p＞0.05）；与EDTA-Na2抗凝组相比，使用肝素和拘椽酸钠时PLT计数降低，且有显著性差异（p＜0.05）。

3.2 红细胞体积检测结果

使用不同抗凝剂的红细胞平均体积测定结果见表2。

表2 不同抗凝剂红细胞平均体积测定结果

从表2可知，不同的抗凝剂对红细胞的体积有较大的影响，且影响结果不同。与枸橼酸钠抗凝的血液相比，使用肝素的血液的红细胞体积较大，但EDTA-Na2对RBC体积的影响最大。

4 讨论

血常规检验就是对血液中的白细胞、红细胞及血小板这3个系统的量和质进行检测与分析。

实验结果表明，大多数抗凝剂对红细胞形态影响不大，不同的抗凝剂对红细胞的结果影响不明显。肝素与枸橼酸钠抗凝血的结果显示，血小板数量降低。

血小板计数的降低可能与放置的时间有关，理论上，在采集血液15～30 min对标本进行测验，因为在这段时间的检验是最为精确的，如果血液放置时间过长，会导致巨大血小板不断地产生，而这种巨大血小板主要分布于红细胞直方图的100～250 FL处，结果会导致测定的血小板数低于实际血小板的数量，这样也会造成血小板计数结果低于实际血小板数量的严重后果，红细胞平均容积就会高出实际容积。抗凝剂的质量对血小板的计数也会有一定的影响，若是出现凝块现象，存在的杂质会随着被检测的血液进入计数池内，而对血小板的计数造成影响。血小板的体积与数量对其测定也有一定的影响，要保证血小板的体积维持在正常状态，以其确保其测得结果的准确性，当体积异常增多时对血小板会有很大的影响。此外，在操作过程中切勿间断对全血标本的混匀处理，所有的测定操作都必须在2 h内完成。

本实验通过采用血小板计数板对血细胞参数进行检测，在计数的过程中存在一定的误差，但计数未超过犬血细胞参数的正常范围，反映了血常规的检验为犬在健康状态的评估、疾病诊断提供了可靠的数据。

5 结论

5.1 在犬血细胞的分析检测中，肝素、枸橼酸钠、EDTA-Na2对犬WBC、RBC、Hb 3项参数差异不显著，无统计学意义；EDTA-Na2对PTL计数差异不显著，肝素和枸橼酸钠使PTL计数下降，具有显著性差异。

5.2 可用EDTA-Na2代替EDTA-K2作为抗凝剂，但EDTA-Na2溶解性能差，混合时间应适当延长，以保证抗凝的效果。

5.3 EDTA-Na2、肝素和枸橼酸钠都能使RBC的体积增大，与枸橼酸钠抗凝的血液相比，使用肝素的血液的红细胞体积较大，但EDTA-Na2对RBC体积的影响最大。