Hg2+肾细胞毒性量效关系及其肾脏蓄积机理与针灸减毒的探究

胡英华，贾炳超，于立清，尚 鑫，孙 波

（长春中医药大学，长春 130117）

朱砂具有镇静、安神功效，但因其同时具有毒性又严重地困扰着医药界，所以针对朱砂毒性的研究经久不衰[1-4]。由于大多研究结果都将朱砂的毒性聚焦于朱砂中的主要成分重金属汞，故汞在机体脏器的蓄积与存在形式[5-7]、汞的代谢动力学[8-10]与代谢组学[11-16]等研究都成了热门话题。然而，对朱砂药性与毒性作用的量效关系研究较少。朱砂的主要成份是HgS，但HgS 溶解度很小，仅为2.943×10-25g，并且HgS 本身不能被吸收，这就意味着可以通过微孔途径被吸收的Hg2+量很小。如此少量的Hg2+是如何经有限的服药期便产生蓄积的呢？蓄积量达到多少才能对细胞的增殖产生影响呢？这无疑是涉及朱砂或含有朱砂成份的中成药能否安全用于临床的关键问题。为了解决上述问题，同时也考虑到朱砂的毒性主要源于其对肾脏的损害，笔者以HEK293 为模型研究了朱砂体外肾毒性的量效关系，并以家兔血液中的Hg2+C-t 关系与其小肠和肾脏的离体实验揭示了存在于吸收过程的Hg2+的蓄积机理，探究针灸的减毒作用。有研究表明，针刺天枢、足三里、上巨虚、大肠俞等可以改善结肠动力，使排便困难程度得以改善。针刺还可以通调三焦腑气，恢复大肠传导功能，增强肠道平滑肌蠕动，从而达到治愈便秘的目的[17]。现代生物学研究也证明，针刺可通过调节患者脑肠肽、c-kit 蛋白及mRNA 表达来改善便秘症状[18-19]。考虑到治愈便秘实际上就是增强肠道对其内容物的推进作用，而这种作用刚好可以减弱朱砂微粒在肠道内壁的吸附力，从而促进朱砂微粒的排泄，缩短Hg2+吸收相，进而减少由此引起的Hg2+在肾脏的蓄积。鉴于天枢、上巨虚、足三里、大肠俞这四个穴位均可以增加胃肠道动力，故以这四个穴位的组合来研究针灸对朱砂的解毒作用。

1 Hg2+肾细胞毒性量效关系模型

1.1 实验材料 SANYO 二氧化碳培养箱（日本SANYO 公司），SANYO 超低温冰柜（日本 SANYO公司），Themo 生物安全柜，BIO-RAD 酶标仪（美国伯乐公司），Mettler Toledo AL 204 电子分析天平（万分之一），TD 40 台式低速离心机（4 000 r/min）（湖南凯达科学仪器有限公司），YXQ-LS-50 立式压力蒸汽灭菌器，可调微量移液器（上海亚荣生化仪器厂），水飞朱砂（河北凯达药业有限公司），硫化汞（北京化工厂），氯化汞（姜堰市环球试剂厂），胎牛血清（浙江天杭生物有限公司），DMEM 干粉培养基（GIBCO），胰蛋白酶（北京鼎国昌盛有限责任公司）。

1.2 实验方法 由于汞是朱砂的主要成分，也是其肾毒性的主要来源，所以该实验用HgCl2来研究朱砂肾毒性与时间和剂量的相关性。根据前期实验结果，取同批次对数生长期HEK 293，用0.01 mol/L 的PBS 润洗3 次，再用0.25%胰酶消化2 min，然后加入100 μLfalse 血清终止消化，与4 mL DMEM 混匀，以1 000 r/min 离心5 min。弃去上清液，与10%高糖DMEM 混匀于培养皿中，计数，转入96 孔板（1.5 万/孔），放入CO2培养箱中，5% CO2，37℃孵育24 h。取出，吸净培养液，加入1%FBS 高糖培养基，放入二氧化碳培养箱中孵育24 h。取出，显微镜下观察生长情况（细胞应长满96-孔板的80%～90%），分别加入事先配置好的HgCl2溶液，在5%CO2，37 ℃孵育36 h，取出，于倒置显微镜下观察，并于每孔加入20 μL falseMTT 溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4 h。终止培养，小心吸取孔内培养液，并于每孔加入160 μLfalse 二甲基亚砜，置涡旋振荡器上，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490 nm 处测量各孔的吸光值，10 min 内测完。

1.3 实验结果 可以拟合出吸光度y 与Hg2+的浓度x 之间关系的动力学模型：Lny=ln1.0173 -0.136x。当Hg2+浓度在0～20 μg/mL 范围内时，该动力学模型吻合度很好。

2 朱砂在家兔肾脏蓄积机理及针灸减毒的研究

2.1 实验材料 AFS-930 原子荧光分光光度计（北京吉天仪器有限公司），SANYO 超低温冰柜（日本SANYO公司），Mettler Toledo AL 204电子分析天平（万分之一），TD 40 台式低速离心机（4 000 r/min）（湖南凯达科学仪器有限公司），Sigma 台式高速冷冻离心机（德国Sigma 公司），可调微量移液枪（上海亚荣生化仪器厂），康牌针灸针（0.25 mm×25 mm）（长春爱康医疗器械有限公司），水飞朱砂（批号：20141213）安国市药材天然粉贸易有限公司。

2.2 实验方法 将市售的朱砂加工成不同分散度的供试样品，并且按照分散度分成不同的实验组。将样品置于4℃恒温环境下，在40 KHz 超声震荡下溶出，于不同时间点取样，分析。结果见表1。

表1 分散度与汞离子溶出度的相关性

根据表1 的结果，并考虑汞在体内的表观分布容积的问题，选择过6 号筛、溶出60 min、Hg2+含量最高的溶液（8.561 µg/mL）作为朱砂饱和溶液实验组给药供试品，取沉淀物0.5 mL 稀释至2 mL 作为朱砂混悬液实验组给药供试品。

2.2.1 血液中Hg2+浓度动态变化 将32 只家兔随机分为4 组，第1 组为阴性对照组，第2 组为朱砂饱和溶液实验组，第3 组为朱砂混悬液实验组，第4 组为朱砂混悬液+针灸实验组。第1 组的家兔灌胃给2 mL水，第2、3 组的家兔分别灌胃给2 mL 朱砂饱和溶液、2 mL 朱砂混悬液水，第4 组的家兔灌胃给2 mL 朱砂饱和溶液并每天针灸天枢、上巨虚、足三里、大肠俞四穴。

以上各组每日灌胃给药1 次，并于每日给药1 h后取全血进行分析，第4 组每日于采血后针灸1 次。结果见表2。

表2 家兔血液中Hg2+浓度（，n =8） μg/mL

注：与阴性对照组比较，# P ＜0.05

2.2.2 小肠洗脱液中Hg2+浓度动态变化 于给药后的第15 天全部处死实验动物，取出小肠和肾脏。并截取小肠1 m，洗净，用模拟肠液以每分钟1 滴的流速冲洗，于每日中午取样分析，结果见表3。

表3 小肠洗脱液中Hg2+浓度（，n =8） ng/mL

表3 小肠洗脱液中Hg2+浓度（，n =8） ng/mL

注：与阴性对照组比较，# P ＜0.05；与朱砂饱和溶液实验组比较，△P ＜0.05

2.2.3 肾脏中Hg2+浓度 用组织匀浆机将肾脏制成匀浆，并转移到1.5 mL EP 管中，用Sigma 台式高速冷冻离心机在-4℃下、14 000 r/min 的条件下离心15 min，取上清液1 mL 于原子荧光分析，结果见表4。

表4 肾脏中Hg2+浓度（，n =8） ng/mL

表4 肾脏中Hg2+浓度（，n =8） ng/mL

3 讨论

根据Hg2+肾细胞毒性量效关系模型可以得出这样的推论。当Hg2+浓度不高于20 μg/mL 时，HEK293 的存活量随着Hg2+浓度的增加而呈对数衰减。当Hg2+浓度为5.2 μg/mL 时，HEK293 的存活率为对照组的50%。

总结2.2.1、2.2.2 和2.2.3 项下第2 实验组与第3实验组的研究结果可知。朱砂具有很强的吸附性，过量的朱砂微小颗粒以其强吸附性附着在小肠内壁，这就使得Hg2+可以缓慢地溶解于肠液，并持续地被吸收，其结果相当于给药剂量不断地增加，给药时间相应地延长，进而导致朱砂因过度吸收而在肾脏蓄积，从而导致肾毒性的增加。如果中成药能够按照朱砂的溶解度投料，那么就可以参照朱砂肾毒性的量效关系控制含有朱砂制剂的给药量及安全用药周期，从而实现临床上的精准用药。

分析2.2.1、2.2.2 和2.2.3 项下第3 实验组与第4实验组的研究结果可以做出这样的预测。对于口服含有朱砂药物者，针灸刺激天枢、上巨虚、足三里、大肠俞这四个穴位可以减少朱砂微粒附着在小肠内壁的时间，缩短朱砂的吸收相，从而起到减毒作用，这一结果可以从经络理论找到依据。天枢是手阳明大肠经的募穴，也是人体气机升降的关键部位，可使脏腑之气通调。上巨虚是手阳明大肠经的下合穴，根据《灵枢·四时气》：“邪在腑，治其合。”的理论，针刺上巨虚来通调腑气，其二者又为“合募配穴法”的应用，可起到相互协调的作用，从而增强疗效。天枢，位于人体上部，上巨虚，位于人体下部，亦属于配穴方法中的“上下配穴法”，上下部的腧穴联合使用，可以通调人体内的气机，从而消除腑病。足三里是足阳明胃经中的重要穴位，《四总穴歌》里有“肚腹三里求”的论述，其高度概括了足三里穴的主治功效，表明通过刺激足三里穴可明显改善胃肠道疾病和不适症状，而足阳明胃经又被称之为“多气多血之经”，因此刺激足三里可明显改善人体内气血运行。天枢、上巨虚、足三里组合使用更是可以加强肠道的气血经气的运行，加快大肠传导功能恢复。大肠俞作为背俞穴，有泻热通便、理气化滞、通调肠腑的功效，与天枢联合使用属于“俞募配穴法”，由于背俞穴和募穴都是脏腑之气输注和会聚的部位，在分布上大体与对应的脏腑所在部位的上下排列相接近，因此，主要用于治疗相关脏腑的病证发挥其协同作用，从而增加疗效。