具有“钢筋混凝土”结构的丝素蛋白增强海藻酸钙支架材料的制备及其性能研究*

吴秋惠，丁硕秋，任天，徐睿婷，周超，赵宝洲，邓林红△，刘杨△

(1.常州大学材料科学与工程学院，常州 213164;2.常州大学生物医学工程与健康科学研究院，常州 213164)

1 引 言

海藻酸盐[1]由于加工简单、生物相容性好、易降解被广泛应用于生物、医药、化学、食品等领域[2-7]。海藻酸钠(sodium alginate，SA)是海藻酸盐的主要来源，它是一种高分子多糖，是由β—D—甘露糖醛酸(M)和α—L—古罗糖醛酸(G)通过1—4糖苷键连接而成的一种线性聚合物[8]。海藻酸钠是具有—COO—的阴离子聚合物，容易在钙离子和其他二价阳离子的存在下形成凝胶[9]。但是，在制备海藻酸钙支架的过程中，单纯的海藻酸钙支架材料存在力学性能不佳、易脆等问题[10-12]。

近年来，具有良好力学性能的丝素蛋白(SF)分子被用来改善海藻酸钙材料易脆的缺点[13-14]。丝素蛋白(SF)是蚕茧的主要成分,是一种天然生物材料，具有优良的生物相容性，韧性和可降解性，被广泛应用于组织工程领域[15-19]。丝素蛋白是由十八种氨基酸组成，其氨基酸中含有大量的氨基、羟基和酰胺基团，海藻酸钙(CA)中含有大量的羟基和羰基基团，可利用羟基—羟基、羟基—酰胺基、氨基—羰基间的氢键作用来提高SF与CA分子间的作用力，增强材料的力学性能[20-21]。Eivazzadeh-Keihan等[22]使用海藻酸钠、聚乙烯醇、丝素蛋白和氢氧化镁纳米棒制备了一种复合支架。实验结果表明，丝素蛋白的引入，增强了材料的机械强度，同时支架具备良好的生物相容性，复合支架的细胞存活率达92%。李宁宁等[23]采用海藻酸钠和丝素蛋白组成的生物墨水,以含5%氯化钙与13%F127的混合溶液作为交联剂，利用同轴打印技术制备具有高度有序排列的可灌结构的血管支架。实验结果表明，打印出的血管支架具有完全贯通的管道结构，有利于细胞黏附和生长，复合支架的细胞存活率可达95%。

本研究通过Ca2+迁移带动SF分散在SA溶液制成一种具有“钢筋混凝土”结构的丝素蛋白/海藻酸钙支架。不同于传统支架，该支架特殊的“钢筋混凝土”结构表现出更好的力学性能。同时，它具有良好的吸水率和孔隙率，使得细胞能在支架中粘附、增殖和分化。

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

SA(AR，阿拉丁)；蚕茧(广西柳州)；溴化锂(LiBr，国药集团化学试剂有限公司)；无水碳酸钠(NaCO3，江苏强盛功能化学股份有限公司)；无水氯化钙(CaCl2，AR 98%，阿拉丁)；碳酸钙(CaCO3，江苏永华精细化学品有限公司)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na，AR98%，阿拉丁)；葡萄糖内酯(GDL，99%，阿拉丁)。胎牛血清(α-DMEM培养基，Sigma-Aldrich，美国)；PBS缓冲液；噻唑蓝(MTT，南京生兴生物技术有限公司)；二甲基亚砜(DMSO，赛默飞世尔科技公司)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)。

精密电子天平(德国Sartorius)；红外光谱仪(美国ThermoNicolet)；扫描电子显微镜(德国Zeiss)；真空冷冻干燥机(美国Labconco)；力学性能试验机(美国BOSE)；酶联免疫检测仪(瑞士TECAN)；激光共聚焦显微镜(德国Zeiss)。

2.2 丝素蛋白(SF)的提取

首先将蚕茧剪开，去除蚕茧中的蚕蛹和内膜并使用去离子水洗净。然后置于0.02 mol/L的NaCO3溶液中，再在100℃水浴下加热脱胶30 min后取出、拧干并用去离子水洗涤2～3次，重复3次脱胶过程。最后在60℃烘箱内烘干，得到丝素蛋白纤维。

先将丝素蛋白纤维放入到9.3 mol/L LiBr溶液中，置于60℃烘箱，每过5 min搅拌一次，直至完全溶解。然后将溶解后的SF溶液倒入截留分子量8～14 kDa的透析袋中，在去离子水中透析3 d，期间每隔4h换一次水。透析期间，使用硝酸银溶液检测透析袋外水溶液，不产生沉淀则透析完成。最后将丝素蛋白溶液置于离心机中离心，得到纯净的SF溶液，放入4℃冰箱内冷藏保存。

2.3 SF/CA支架的制备

先称取2.22 g无水氯化钙溶于100 mL去离子水，后加入7.45 gEDTA-2Na，充分螯合形成0.2 mol/LEDTA-CaCl2溶液。再在每13 mLEDTA-CaCl2溶液中加入1 g葡萄糖内酯GDL和2 mLSF溶液。接着配制质量分数为3wt%的SA溶液置于24孔板，每孔1.5 mL。又将EDTA-CaCl2、GDL和SF混合溶液以每滴20 μL，间隔30 s的速度滴入SA溶液中，总约20滴。最后将其冷冻干燥制成支架，记为SF/CA1。

先称取2g碳酸钙溶于100 mL去离子水，后加入7.45 g EDTA-2Na，充分螯合形成0.2 mol/L EDTA-CaCO3溶液。再在20 mL质量分数为3 wt%的SA溶液中加入1 mL SF溶液，搅拌5 min。接着确定P=[Ca2+]/[COO—]=0.18、确定Q=[GDL]/[Ca2+]=2，加入对应量的0.2 mol/L EDTA-CaCO3溶液和GDL粉末，搅拌5 min。最后将其注入24孔板，冷冻干燥制成支架，记为SF/CA2。

先配制质量分数为3wt%的SA溶液和0.2 mol/L CaCl2溶液。然后在20 mLSA溶液中加入1 mL SF溶液，搅拌5 min。再加入2.7 mL CaCl2溶液,搅拌5 min。最后将其注入24孔板，冷冻干燥制成支架，将其记为SF/CA3。

2.4 材料性能的表征

2.4.1红外分析 为了获得SF/CA支架的官能团信息,使用红外光谱仪(美国ThermoNicolet)进行分析。分辨率为2 cm-1，扫描波波数范围为500～4 000 cm-1。

2.4.2形貌分析 为了获得SF/CA支架的形貌，孔径大小以及丝素蛋白在支架中的分布状况，使用数码相机、扫描电镜、共聚焦显微镜对支架进行观测。

2.4.3孔隙率的检测 为了获得SF/CA支架的孔隙率，使用比重瓶，采用重量法测量孔隙率。每组支架重复测量3次，取其平均值。孔隙率公式如下：

(1)

式中，ε为支架孔隙率；w0为比重瓶装满乙醇后的总质量；w1为支架质量；w2为组织支架完全排出气泡后充满乙醇后的质量；w3为把支架从乙醇中 取出后剩余物的总质量。

2.4.4吸水率分析 为了获得SF/CA支架的吸水率。使用PBS缓冲液测试不同时间段吸水后支架的重量。每组支架重复测量3次，取其平均值。孔隙率公式如下：

(2)

式中ζ为支架吸水率；wx为不同时间段支架质量；wi为支架初始的质量。

2.4.5力学性能检测 为了评价SF/CA支架的抗压性能，使用BoseELF3200生物材料力学测试系统对支架进行抗压强度的测试。按照GB-T1041-192的标准测试多孔支架的压缩强度。加载速度为0.5 mm/sec，每组为5个样品。

由于SF/CA 3支架的结构明显不均匀，故只对SF/CA1和SF/CA2支架材料进行力学性能测试。

2.4.6MTT法检测细胞毒性 为了评价SF/CA支架的生物相容性，使用MTT法检测支架的细胞毒性。取生长状态良好的MC3T3-E1细胞制备成密度为5×104个/mL细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL，置于37°C、5%CO2细胞培养箱内培养24 h，待细胞贴壁后，吸去原培养基，PBS缓冲液洗涤2次。3组分别加入200 μL浸提液，对照组加入200 μL完全培养基，继续培养，培养至1、3、5、7 d后，加入20 μL MTT液，培养4 h后弃去原培养液，每孔加入150 μL DMSO，低速摇床避光震荡10 min，用酶标仪于490 nm波长测定吸光度(A)值，取平均值。

2.5 统计学分析

所有实验数据均用平均值±标准偏差表示，样品组≥5。单因素方差分析用于评估统计学显著性，P≤0.05为差异有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 红外分析

为了验证三种丝素蛋白/海藻酸钙(SF/CA)复合支架是否成功制备，本研究进行了红外分析，见图1。

图1 SF/CA支架的红外光谱图

纯SA的红外光谱显示2 925 cm-1处为C—H的伸缩振动吸收峰；1 617 cm-1处是SA中C—O—C伸缩振动峰；在1 416 cm-1处为—COO—的对称伸缩振动峰，在1 036 cm-1处是SA中O—H弯曲振动峰。纯SF的红外光谱显示1 632 cm-1和1 540 cm-1处的峰分别是β-折叠构象(Silk II)的酰胺I和酰胺II的特征吸收峰。同时，在1 234 cm-1峰属于无规卷曲结构(Silk I)的酰胺III的特征吸收峰[24]。而且，在1 055 cm-1处的峰归因C—N拉伸振动吸收。

丝素蛋白/海藻酸钙(SF/CA)复合支架的红外光谱显示，SF在1 632 cm-1处具有较强的吸收峰，使得CA的C—O—C的伸缩振动峰的特征吸收峰消失。而SF酰胺II的特征吸收峰在1 540 cm-1处消失，这归因于SF和CA分子之间发生氢键相互作用[25-26]。在1 234 cm-1出现SF酰胺III的特征吸收峰，表明支架中含有少量SF的成分。SF/CA复合支架在1 416 cm-1， 1 036 cm-1为CA的特征吸收峰。说明三种SF/CA复合支架既含有SF成分，又含有CA成分，并且SF的构象并没有发生变化。

3.2 形貌分析

对于应用于组织工程的支架而言，必须具有良好的三维多孔结构以满足细胞的生长等性能，为了研究新型支架“钢筋混凝土”结构与传统支架结构的区别，我们对其结构进行观察，见图2。图2(a)、图2(b)、图2(c)从左至右分别为支架SF/CA 1、SF/CA 2、SF/CA 3的数码图、荧光图、低倍SEM图、高倍SEM图。

图2 SF/CA支架的形貌图

首先对支架SF/CA1的形貌进行分析，数码图显示该支架表明粗糙，不平整，存在一圈圈的波纹；从荧光图可看出丝素蛋白在支架中具有一圈圈波纹的分布，中间相互连接，有间隙；由SEM图可知支架表面存在一圈圈波纹，波纹之间粗糙，不存在孔隙，波纹粗糙，不规则。

其次对支架SF/CA2的形貌进行分析，数码图显示该支架表面粗糙，平整，存在有规律的孔隙。从荧光图可看出丝素蛋白在支架中分布较均匀，支架呈多孔结构。由SEM图可知，孔主要为长圆形和圆形，孔径大小不一，孔隙较密，孔隙在100～200 μm，孔壁光滑。

最后对支架SF/CA3的形貌进行分析，数码图显示该支架表面粗糙，不平整，存在无规则的孔隙，支架松散，不是一个完整的圆柱形支架。从荧光图可看出丝素蛋白在支架内部分布不均匀。由SEM图可知，支架表面粗糙，存在不规则孔隙，孔不规则，孔壁光滑。

3.3 孔隙率分析

高孔隙率的材料能够提供足够的空间并吸收足够的营养物质，从而有利于体内物质的交换。支架SF/CA1是通过Ca2+在SA溶液中离迁移带动丝素蛋白分散所制备的支架，具有一种特殊的“钢筋混凝土”结构，有较高的孔隙率。其多孔结构和高孔隙率能够使其具有高吸水性、高营养物质渗透能力，有利于细胞的黏附和生长。而支架SF/CA2内部结构均一，孔隙较小介于100～200 μm。支架SF/CA3在制备过程中，CaCl2的加入，使得SF/SA溶液立即发生交联，不存在Ca2+缓慢释放的过程，导致所制备的支架内部结构不均匀，本研究所测该支架这一部位的孔隙较小。支架孔隙率见图3。

图3 SF/CA支架的孔隙率

3.4 吸水率分析

吸水率是组织工程支架材料的重要评价因素之一。由图4可知，用PBS缓冲液浸泡支架SF/CA2和SF/CA3，30 min后，吸水率无变化。而支架SF/CA1随着时间的增加，吸水率逐渐增加，在6 h时支架吸水能力达到饱和。3种支架的吸水率均高于90%，这与丝素蛋白含有大量羧基、羟基、氨基和海藻酸钙中含有大量羧基、羟基这些亲水基团有关。

图4 SF/CA支架的吸水率

此外，支架SF/CA2和SF/CA3的吸水率均高于支架SF/CA1，这归因于支架SF/CA1特殊的“钢筋混凝土”结构。

3.5 力学性能分析

由图5可知，支架SF/CA2随着压缩程度的增加，应力逐渐增加；支架SF/CA1随着压缩程度的增加，应力逐渐增加，当压缩达到30%时，应力显著提高。支架SF/CA2与支架SF/CA1的抗压强度分别为(11.10±2.61) KPa与(72.68±6.73) KPa；杨氏模量分别为(22.20±5.22)KPa与(145.36±13.46) KPa。表明通过离子迁移方式制备的具有“钢筋混凝土”结构的SF/CA支架相比于传统机械共混所制备的支架具有更好的力学性能。丝素蛋白通过Ca2+迁移，进行定向排列，最后支架表面呈现波纹状。在压缩过程中，这些定向排列的丝素蛋白起着“钢筋”的作用，以抵抗压缩形变，故呈现出更高的抗压强度和杨氏模量。

图5 SF/CA支架的力学性能

3.6 细胞毒性检测分析

为了定量测定三种丝素蛋白/海藻酸钙(SF/CA)支架对细胞的毒性影响，我们将MC3T3细胞接种到支架的浸提液中进行了MTT测试，见图6。海

图6 MTT法检测MC3T3-E1细胞的增殖情况

藻酸钠是一种天然的聚阴离子聚合，带有大量负电荷。MC3T3-E1细胞是小鼠胚胎成骨细胞，其细胞膜因其磷脂双分子层结构而带负电荷，与海藻酸钠发生排斥反应，故而不能促进细胞增殖。但支架的浸提液中细胞都随着时间的增加表现出增殖情况，表明支架无细胞毒性。

4 结论

本研究以SF和SA为原料，区别于传统机械共混SF和SA溶液的方式，通过离子迁移的方式制备了一种新型丝素蛋白/海藻酸钙支架。通过FT-IR表征支架的结构，表明所制备的复合支架含有SF和CA成分。通过形貌分析支架的表面形貌，证明了该支架具有“钢筋混凝土”结构。支架的吸水率和孔隙率表明其具有较高的吸水率和孔隙率，适合细胞生长。力学性能实验表明该新型支架具有更优越的力学性能。细胞毒性实验表明，成骨细胞MC3T3-E1细胞能在支架上黏附、生长、增殖。该支架在骨组织工程中具有良好的应用前景。