淀粉-海藻酸盐复合止血材料的制备及性能研究*

朱肖杰，孟建文△，朱小敏，罗西友，张素文，马学彬，杨忠波

(1. 山东省药学科学院，山东省医用高分子材料重点实验室，济南 250101；2. 山东黄河河务局山东黄河医院，济南 250032)

1 引 言

止血技术是外科手术处理创面的关键技术，良好的止血材料是临床手术成功的关键。目前常用的止血材料有沸石基止血材料[1]、明胶类止血材料[2]、壳聚糖类止血材料[3]以及淀粉基止血材料[4]。

淀粉基止血材料是以淀粉或其衍生物为原材料制备的止血材料[5]，因其良好的生物相容性、无免疫原性、生物可降解性、止血作用优异等[6-7]，在战争及外科手术(如术中加压、结扎或其他常规止血措施无效或无法实施时)中得到广泛的研究和应用[8]。淀粉基止血材料属于外源性凝血，通过吸收血液中的水分，使血小板和凝血因子浓缩，增强其凝聚速度和凝聚力，从而提高止血效率。目前临床上普遍应用的AristaTM外科术中止血装置是淀粉基止血材料的典型代表[9-10]，市售产品“瞬时”复合微孔多聚糖止血粉是在淀粉基材上引入羧甲基壳聚糖，增强凝血反应，加快止血速度，但壳聚糖作为动物源性材料，免疫原性问题不可避免，可能会诱发如：结膜充血、听力下降、面部麻木、视物模糊、疼痛等神经系统的微循环障碍与组织的缺血缺氧等不良反应[11-12]。

海藻酸盐是一种天然线性多糖聚合物，由(1→4)—β—交联的D-甘露糖醛酸和(1→4)—α—交联的古洛糖醛酸组成的长链聚合物，广泛存在于海带及其他褐藻类植物的细胞壁和细胞间质中[13-14]。其生物相容性好，具有抑菌、促愈合等优点，已在组织工程、药物载体等生物医用领域得到广泛应用[15-16]。大量研究证明，海藻酸类止血材料具有透氧性好，能促进组织生长[17-18]，减少疼痛[19]。与壳聚糖相比，其生物相容性好、无免疫原性问题，近年来，被越来越多的应用于外科手术、鼻腔术后及穿刺部位出血等，效果显著[20]。

本研究以淀粉和海藻酸盐为主要基材，制备了淀粉-海藻酸盐复合止血材料，避免了动物源性材料导致的免疫原性问题，既能安全有效地止血，又能促进创面愈合，拓展了多糖类止血材料在生物医学方面的应用。

2 材料与方法

2.1 主要原料和试剂

马铃薯淀粉(药用辅料，安徽山河药用辅料有限公司)；氢氧化钠(分析纯，天津百世化工有限公司)；海藻酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氯化钙(分析纯，上海展云化工有限公司)；液体石蜡(分析纯，莱阳市康德化工有限公司)；司班80(分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司)；环氧氯丙烷(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；无水乙醇(分析纯，天津市百世化工有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，山东禹王和天下新材料有限公司)。

2.2 仪器设备

电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；电动搅拌器(天津华兴伟业实验仪器有限公司)；真空干燥箱(巩义市英峪予华仪器厂)；SUPRE 55扫描电子显微镜(德国Zeiss公司)；Thermo Nicolet iS50傅立叶变换红外光谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)。

2.3 淀粉-海藻酸盐复合止血材料的制备

称取5.0 g司班80于三口烧瓶中，加入1 000 mL液体石蜡，置60℃水浴中搅拌均匀，作为油相备用。将20.0 g马铃薯淀粉加入到200 mL水中，置65℃水浴中搅拌糊化20 min，制成淀粉液。将1.0 g海藻酸钠溶于少量水，加入到淀粉液中并搅拌均匀，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调混合液pH为10，作为水相。将水相缓慢加入到油相中，搅拌至均匀乳液状后再缓慢滴加1 mL环氧氯丙烷，搅拌10 min至均匀。将反应体系置60℃水浴中，以500 r/min的速度搅拌反应6 h，反应结束后，称取1.0 g氯化钙加少量水溶解，加入到上述体系中，继续搅拌反应1 h。

加入300 mL乙醇搅拌至破乳，静止1 h，倒掉上清液。下层产物加入300 mL乙醇搅拌30 min，过滤。将过滤后颗粒物用乙酸乙酯以同样方法清洗。乙醇和乙酸乙酯交替清洗产物3次，过滤产物在60℃下干燥3 h，得粉末状淀粉-海藻酸盐复合止血材料。

2.4 扫描电镜(SEM)测试

在粉末状淀粉-海藻酸盐复合止血材料表面进行喷金处理，通过SEM观察止血材料表面的形貌特征。

2.5 红外光谱测试

用无水 KBr 对样品进行压片后，通过傅里叶红外光谱分析仪(FT-IR)分析样品结构。

2.6 吸液性能测试

取样品0.1 g于15 mL干燥洁净离心管中，记为M1，加模拟体液(SBF)[21]10 g，震荡摇匀，3 000 r/min转速下离心5 min。倒出上清液，上清液称重记为M2，吸水率以式(1)计算。

吸水率=(10-M2)/M1

(1)

2.7 体外凝血测试[22-24]

从健康新西兰兔上采集新鲜血液，与抗凝管中的柠檬酸钠立刻混合，混合体积比为1∶9，备用。抗凝兔血、氯化钙溶液(0.2 mol/L)使用前置37 ℃水浴预热。离心管中加入0.6 mL抗凝兔血，将0.02 g样品和60 μL氯化钙溶液，同时加入离心管，启动凝血并开始计时。每10 s倒置观察，血液完全凝固的时间即为动态全血凝固时间。所用样品分别为淀粉-海藻酸盐复合止血材料、海藻酸盐止血材料、纯淀粉止血材料。空白实验不加样品，用同样方法处理。

2.8 大鼠肝脏止血试验

取健康SD大鼠30只，随机分为3组，即模型组、供试品组和上市对照品组，每组10只。其中模型组、供试品组、上市对照品组样品依次为无菌医用纱布，淀粉-海藻酸盐复合止血材料，外科术中止血装置AristaTM。大鼠经1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后开腹，暴露肝脏左叶，用组织剪在肝脏左叶中间位置切取大小一致(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)的肝组织，造成敞开型伤口。医用纱布迅速擦拭出血创面后，立即将适量供试品直接洒在出血部位，表面覆以无菌纱布和30 g砝码压迫止血，每30 s观察一次，直至止血完成，见图1。记录止血时间和出血量。上市对照品做同样处理。模型对照组使用已精确称重的无菌医用纱布敷压创口。

出血时间：从出血创面应用样品或纱布到出血完全停止。

出血量(mL)=(止血后纱布重量-止血前纱布重量)/血液比重(1.050 g/mL)

图1 大鼠肝脏止血试验

3 结果与讨论

3.1 形貌表征

通过SEM观测淀粉-海藻酸盐复合止血材料的形貌特征，其表面呈粗糙、多孔状，见图2。该形貌有利于增强对皮肤的黏附和对血液中水分的吸收，从而实现材料的快速止血性能。

图2 淀粉-海藻酸盐复合止血材料的SEM图Fig.2 SEM of starch-alginate composite hemostatic material

3.2 红外光谱分析

对马铃薯淀粉、海藻酸钠、淀粉-海藻酸盐复合止血材料进行红外表征，结果见图3。对比马铃薯淀粉和淀粉-海藻酸盐复合止血材料的红外光谱图，马铃薯淀粉在977 cm-1处存在伯醇的C—O伸缩振动吸收峰，而淀粉-海藻酸盐复合止血材料在977 cm-1处无吸收峰，说明在C6位的伯醇羟基发生了反应，可能与其空间位阻小有关[25-26]。海藻酸钠在1 609 cm-1和1 416 cm-1处存在—COO—的不对称和对称伸缩振动，而反应后移动到了1 636 cm-1和1 418 cm-1处，说明海藻酸钠参与了反应[27]。

3.3 吸液性能

快速有效的止血材料一般具备强的吸液性能，其在伤口表面一般具有双重止血机理：一是可以快速吸收流出的血液并激发凝血系统，形成生理性血凝块，有效封堵伤口；二是通过吸水膨胀产生内吸力，吸附有形成分[28]，形成机械性血凝块，达到快速的止血效果[29-30]。本研究测试了海藻酸盐止血材料、纯淀粉止血材料和淀粉-海藻酸盐复合止血材料对模拟体液的吸液率[31]，见图4。海藻酸盐止血材料和纯淀粉止血材料对模拟体液的吸液率分别为6.22倍和10.94倍，淀粉-海藻酸盐复合止血材料吸收能力最强，吸液倍率为21.32倍，是海藻酸盐止血材料的3.42倍，是纯淀粉止血材料的1.95倍，表明了淀粉-海藻酸盐复合止血材料优异的吸液性能。这种高吸液性能可能是由于海藻酸盐中含有大量的羧基，亲水性强，在淀粉的基础上引入海藻酸盐，增强了淀粉的亲水性，从而提升了材料的吸液性能[32]。

图3 马铃薯淀粉、海藻酸钠和复合止血材料的红外光谱图Fig.3 Ir spectra of potato starch, sodium alginate and composite hemostatic materials

3.4 体外凝血

本研究分别将淀粉-海藻酸盐复合止血材料、海藻酸盐止血材料和纯淀粉止血材料进行体外凝血测试，其动态全血凝固时间见图5。与空白全血凝固时间185 s相比，海藻酸盐止血材料平均全血凝固时间为169.3 s，时间缩短了8.49%；纯淀粉止血材料平均全血凝固时间为165.7 s，时间缩短了10.43%；而淀粉-海藻酸盐复合止血材料样品的平均全血凝固时间为132 s，时间缩短了28.65%，说明该材料有加速凝血的作用，是一种性能优异的止血材料。

图4 吸液性能测试图 Fig.4 Test diagram of suction performance

淀粉-海藻酸盐复合止血材料的制备过程中，先加入马铃薯淀粉和海藻酸钠，交联反应结束后，加入氯化钙，氯化钙中的钙离子和反应体系中的钠离子发生置换[33-34]，以海藻酸钙的形式存在，海藻酸钙可促进红细胞聚集[35]，形成血栓[36-37]。钙离子在凝血过程中被称为凝血因子Ⅳ，可与其他凝血因子将凝血酶原转化成凝血酶，参与到内外源性凝血途中的多个环节。在纯淀粉止血材料的基础上引入海藻酸和钙离子，加速凝血进程，提高止血速度，止血性能得到进一步提升[20]。

图5 动态全血凝固时间 Fig.5 Dynamic whole blood coagulation time

3.5 大鼠肝脏止血

大鼠肝脏止血试验按照2.8所述方法进行。结果见图6。

图6 大鼠肝脏止血试验

与模型组相比，供试品组可缩短大鼠肝脏创面止血时间57.9%，出血量减少64.3%。相比于上市对照品组，供试品组大鼠肝脏创面止血时间缩短9.0%，出血量减少43.6%，止血效果比市售产品有一定的提高。

4 结论

本研究采用反相乳液法得到淀粉-海藻酸盐复合止血材料。该材料呈粗糙多孔状，吸液性能优异，对模拟体液吸液率达20～22倍。体外凝血测试时，凝血时间比空白缩短了28.65%。大鼠肝脏止血试验表明，该材料与无菌医用纱布和市售产品AristaTM相比，止血时间分别缩短了57.9%和9.0%，出血量分别减少64.3%和43.6%，明显缩短了创面的凝血时间，减少了出血量，是一种快速有效的止血材料。该材料在外科手术等临床应用中，具有良好的前景。