氨基酸代谢变化引起的c-di-GMP稳态波动对大肠杆菌致病过程中菌毛合成的影响

孙敏,高兴,任方勋,白乾坤,泮欣铭,马家乐*,姚火春

(1.江苏省农业科学院兽医研究所,江苏 南京 210014;2.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

尿道感染(urinary tract infection,UTI)是世界范围内最普遍发生的泌尿科疾病之一,其中75%～90%的社区获得性UTI是由尿道致病性大肠杆菌(UPEC)引起的[1-2]。此外,UPEC还是引起伴侣动物(宠物猫、狗等)尿路感染、子宫蓄脓等疾病的主要病原之一,在主人及伴侣动物之间存在相互传播的风险,应作为人畜共患病原而引起重视。以往对UPEC致病机制的研究主要集中在病原特异性毒力因子,包括铁摄取、毒素、黏附,免疫逃避机制及经典毒力因子调控机制[3]。最近对宿主-UPEC交互及尿道环境适应机制的探索拓展了对UPEC致病机制的理解,进一步促进了新型抗菌制剂靶标鉴定的发展[4-7]。

氨基酸饥饿(amino acid starvation,AAS)是细菌氨基酸代谢的一种极端状态,包括氮元素摄取不足导致的各类氨基酸合成障碍,以及某一类必需氨基酸摄取及合成不足。细菌在致病过程中,往往会经历多个短暂的氨基酸饥饿状态,若致病菌突破了宿主的屏障则可迅速获得氨基酸的补充并完成定殖,若突破失败则被宿主清除。细菌能够合成多种信号分子,包括ppGpp、sigma因子及第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)等,调控自身在氨基酸饥饿状态的生长代谢及毒力发挥。c-di-GMP参与调控病原菌的多种生理活动并显著影响其毒力发挥,是细菌中广泛存在的第二信使[8]。不同于全局调控信号分子ppGpp在整个菌体内发挥作用,c-di-GMP 多在菌体内局部区域发挥作用,因此细菌编码了很多c-di-GMP合成酶及降解酶基因[8-9]。c-di-GMP 在病原菌体内的浓度受到严格调控,其合成依赖于包含GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)实现,而其降解则由含有EAL 或 HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDE)完成[10]。通过DGC合成酶及PDE降解酶调控胞内c-di-GMP浓度的瞬息变化,进而快速调控其生物学特性[11-12]。

尿液是UPEC从肠道或体外环境进入到尿道后首先遇到的一个重要的宿主体内环境,营养相对匮乏。已有研究证实因为核酸代谢、糖代谢及三羧酸循环的紊乱而严重影响大肠杆菌在尿液中的生长[3]。正常机体尿液中的蛋白质或氨基酸的含量极其微量,因此尿道致病性大肠杆菌必须通过自己的氨基酸合成网络才能满足自身生长对氨基酸的需求[13-14]。在尿液中生长的细菌是否面对氨基酸饥饿以及是否通过 c-di-GMP 实现对其生理功能的快速调控,值得进一步研究。尽管小鼠UTI模型被认为是一个研究UPEC致病机制的有效模型[15-16],但是在体外使用人尿液进行细菌培养能够部分模拟宿主尿道环境,是一个更简便易行的模型。尿液及LB培养UPEC的比较转录组试验已经成功鉴定许多上调基因是UPEC在尿道中最优化生长所必需的[17-18]。通过对人尿液培养的UPEC进行转座子技术操作及蛋白组学分析则发现了许多有价值的信息[15,19]。

本课题组前期使用mini-Tn5转座系统在UPEC强毒分离株构建了一个转座子突变体文库来测定这些突变体在人尿液中的生长缺陷[20],发现总计有20余个突变体菌株在尿液中显现可重复的及实质性的生长能力减弱,通过对插入失活基因的鉴定发现它们中的半数涉及氨基酸合成。基于上述发现,本研究希望鉴定与UPEC在人尿液中最优化定殖相关的氨基酸代谢机制,并探索c-di-GMP感应氨基酸代谢变化调控UPEC致病性的机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以UPEC强毒株UTI89为对象,构建转座子突变体文库及相关的缺失株,进行后续的验证试验。大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)购自上海Invitrogen公司。大肠杆菌菌株在Luria-Bertani(LB)肉汤(Oxoid)37 ℃培养,需要时添加50 μg·mL-1卡那霉素、100 μg·mL-1氨苄青霉素、25 μg·mL-1氯霉素或30 μg·mL-1萘啶酸。pGEN-pcm由美国爱荷华州立大学李干武教授馈赠。原核表达载体pET21a(+)购自Novagen公司。异亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸等使用生理盐水配制成工作浓度的20×溶液,经过0.22 μm滤器2次过滤除菌后备用。试验用菌株详见表1。

表1 试验中用到的菌株Table 1 Summary of bacterial strains used in this study

1.2 主要试剂和仪器

2×TaqPCR Master Mix、GoldView核酸染色剂为南京诺唯赞生物技术有限公司产品;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、DNA Marker、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自大连TaKaRa生物工程公司;细菌RNA提取试剂盒购自Omega生物技术公司;其余试剂为进口或国产分析纯;引物由苏州金唯智引物合成部合成。

MyCycler PCR仪、紫外分光光度计、电击转化仪、电击杯、凝胶成像系统均为Bio-Rad公司产品;Step-one plus荧光定量PCR仪为ABI公司产品;NANODROP 2000微量分光光度计购自Thermo Scientific公司。96孔分光光度计(GloMax-Multi,Promega)用于测定突变体文库在人尿液中生长的D600数据[21]。

1.3 DNA编辑操作

DNA片段扩增、连接和电转化按照分子克隆的标准方法执行。缺失株的构建采用本课题组成熟的λ Red同源重组技术[22],构建了ilvGMEA、metJBL、argBCH、leuDCBA、proBA、cysCND、pheAL、asnAC、serB、glnGA、glyA、hisP-J、lysAR、glyA、tyrA及thrABC涉及16种氨基酸合成基因或基因簇的16个缺失株,以及涉及yciR、mlrA、ycgF及ycgE这4个基因的6个缺失株。互补菌株的构建选择pGEN MCS质粒作为载体,在其EcoRⅠ和NdeⅠ酶切位点间插入一个在大肠杆菌可恒定表达的Pcm启动子,目的基因被克隆进入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,受Pcm启动子控制。

1.4 野毒株及缺失菌株在体外人尿液中的生长比较

人尿液采集参考文献[20]进行:征集20～50岁身体健康的男性及女性志愿者各10名,签订知情同意书后,收集晨尿的中段尿,混合后进行过滤除菌,-80 ℃保存备用。从新鲜培养的平板上点取UPEC单菌落转接至2 mL人尿液中,37 ℃培养8 h后,使用分光光度计测定D600值,比较野毒株及缺失菌株在体外人尿液中的生长差异。

1.5 尿道感染试验比较基因缺失株与野毒株的致病力差异

将所需菌株按1∶100(体积比)分别接种于LB培养基,待其生长至对数生长期(D600≈0.6～0.8)时收集菌体,用无菌PBS洗涤2～3次,用PBS重悬备用。用异氟醚麻醉CBA/J小鼠,待小鼠呼吸均匀并对锐器刺激无反射时,将其仰卧,轻轻按下腹部,排除剩余尿液,尿道外口用酒精棉消毒。左手用镊子轻轻夹住阴蒂上部并向斜上方提起约45°,将套有软管的针头浸润医用润滑剂后缓缓插入尿道外口。插入时可左右移动针头找到无阻力的方向使软管缓缓滑入约1.0～1.5 cm。缓慢降低注射器至接近小鼠水平时注射50 μL菌液(109CFU),操作结束后小鼠断水2 h,定时观察并记录小鼠生存状况。对照组小鼠以同样的方式灌注无菌PBS。同时,为了分析氨基酸代谢失衡对大肠杆菌尿道定殖的影响,将相应的突变株与野毒株1∶1(体积比)混合,然后通过尿道注射(109CFU)感染小鼠。接种48 h后处死小鼠,无菌取膀胱及肾脏,组织匀浆后进行10倍比稀释,再均匀涂布麦康凯琼脂平板,37 ℃培养24 h后统计结果。

1.6 荧光定量PCR

用Omega公司的细菌RNA提取试剂盒,提取大肠杆菌RNA;NANODROP 2000分光光度计测定RNA样品纯度与浓度。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Kit 除去基因组DNA污染后,将上述产物反转录合成cDNA。具体步骤参照试剂盒说明书。反应体系为20 μL,反应程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,冰上快速冷却后-20 ℃保存待用。

使用试剂盒进行qPCR试验,反应体系为20 μL。Step-one plus荧光定量PCR仪的反应参数设置为40个循环。使用tus基因作为内参[23],实时定量扩增papB、fimB、fyuA、chuA、sitA、iutA、kpsC、hlyA、tsh、pic、flhD、fliC、bcsA、sat、upaB、upaC、csgB等重要的毒力相关基因,再根据2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。所有反应均在相同条件下进行,每个样品重复3次。

1.7 凝胶阻滞试验(EMSA)测定转录调节因子与DNA靶标的互作关系

接种含有pET28a-mlrA或pET28a-ycgE质粒的BL21(DE3)至100 mL LB培养基中,37 ℃摇床培养至D600≈0.6时,加入0.1 mmol·L-1IPTG,置于28 ℃摇床继续培养6 h后。按照文献描述的方法纯化MlrA及YcgE融合蛋白[24],最终用EMSA 结合缓冲液(10 mmol·L-1Tris-borate,40 mmol·L-1KCl,体积分数是7.5% glycerol,5 mmol·L-1MgCl2,100 μmol·L-1MnCl2,4 mmol·L-1DTT,BSA 100 μg·mL-1,pH 7.5)透析,分装后于-80 ℃保存待用。通过设计特异引物从细菌基因组模板中扩增获得DNA探针。MlrA/YcgE蛋白与DNA探针的互作在25 μL体系中进行,每个体系包含DNA探针100 ng,MlrA/YcgE蛋白自25 ng开始按 2倍比加至100 ng,补足结合缓冲液至25 μL,然后37 ℃孵育30 min。反应液随后在0.5×TBE缓冲液中进行非变性60 g·L-1丙烯酰胺凝胶电泳(200 V 45 min)。蛋白胶在包含1×SYBR Green核酸染料的电泳缓冲液中染色30 min,观察成像并拍照记录。

1.8 lacZ融合菌株的构建及β-半乳糖苷酶活性的测定

分别取2 mL供体菌(S17带有pVIK112重组质粒)和UPEC受体菌,4 000 r·min-1常温离心10 min,弃上清液后用1 mL灭菌水重悬菌体。重复洗涤2次(以去除抗生素)后,分别用50 μL灭菌水重悬供体菌及受体菌,按1∶1(体积比)混合后接种于无抗性平板,37 ℃静置培养4 h后轻轻刮下菌苔,用1 mL灭菌水洗2次后,将菌体重悬并均匀涂布双抗平板(50 μg·mL-1卡那霉素及30 μg·mL-1萘啶酸)。37 ℃过夜培养后,挑取双抗平板上的单菌落转接至新的双抗平板,经PCR鉴定后保存备用。

用灭菌水将过夜培养的带有目的基因启动子-lacZ融合质粒的菌株通过离心重悬的方法洗涤2次,然后转接相应的培养基中,37 ℃培养至对数生长后期或稳定期。取一定量菌液,离心,弃上清液,沉淀重悬于Z缓冲液中,测定D600值。根据需要按1∶1或1∶9(体积比)用Z缓冲液进行稀释,加入适量的氯仿和十二烷基硫酸钠(SDS),剧烈涡旋10 s,静置5 min以充分裂解细胞。加入底物ONPG(邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷)后,统计变黄的时间(t)。加入1 mol·L-1碳酸钠终止反应,测定D420、D550及D600值。β-半乳糖苷酶活性=1 000×(D420-1.75×D550)/t×0.1×D600)。每组试验至少重复3次。

1.9 统计分析

采用GraphPad Prism 5.01统计软件进行数据分析处理。细菌尿液生长试验用双尾t测验进行差异显著性分析,尿道定殖试验用Wilcoxon配对检验分析。

2 结果与分析

2.1 精氨酸、异亮氨酸及蛋氨酸代谢失衡对大肠杆菌尿液生长的影响

根据前期转座子突变文库的尿液生长缺陷结果[20],进一步分析发现与尿液生存相关的氨基酸合成基因主要涉及精氨酸(carAB、argBC及argG)、蛋氨酸(metAB)及异亮氨酸(ilvB、ilvD及ilvE)。此外,涉及亮氨酸(leuA及leuC)和脯氨酸(proB)合成的个别基因的转座失活对细菌在尿液的生长也有轻微影响。

为了再次鉴定这些基因是否确实涉及UPEC的尿液生存,并且补充由于转座子突变体库覆盖率不足导致的可能的遗漏,我们构建了涉及16种必需氨基酸合成基因的非极性缺失株(图1-A)。结果显示:仅精氨酸(ΔargBCH)、蛋氨酸(ΔmetJBL)及异亮氨酸(ΔilvGMEDA)合成基因的缺失株与野毒株相比显示出显著的尿液生长缺陷,且在尿液中添加0.1 mmol·L-1对应的氨基酸可以完全修复ΔilvGMEDA、ΔmetJBL和ΔargBCH的生长缺陷至野毒株的水平(图1-A、B)。

假定通过精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸的合成,可以弥补大肠杆菌直接摄取尿液中上述氨基酸的不足,从而实现最优化生长。为了验证上述假设,我们测定了ΔmetJBL在添加12.5 和25 μmol·L-1或不添加蛋氨酸的M9培养基(仅添加甘油作为碳源的培养基)中的生长特性。结果显示:不添加蛋氨酸,ΔmetJBL完全不能生长;添加12.5 μmol·L-1蛋氨酸可以修复ΔmetJBL的生长至尿液中的水平;而添加25 μmol·L-1蛋氨酸则能够完全修复其生长至野毒株水平(图1-B)。此外,往尿液中添加12.5 μmol·L-1蛋氨酸可以修复ΔmetJBL的生长至野毒株的水平。上述结果提示尿液中蛋氨酸浓度大约为12.5 μmol·L-1,而UPEC的最优化生长需要约25 μmol·L-1。随后,我们在ΔilvGMEDA(上述基因缺失同时破坏亮氨酸及缬氨酸合成,故添加亮氨酸及缬氨酸补足)及ΔargBCH开展了类似的试验,结果表明UPEC的最优化生长需要约 25 μmol·L-1异亮氨酸及50 μmol·L-1精氨酸的(图1-B),而尿液中的两者实际浓度均显著不足。上述结果表明精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成基因是UPEC在尿液中最优化生长所必需的。

图1 精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸对于维持大肠杆菌在尿液中生长的作用Fig.1 The arginine,methionine and isoleucine were required for the optimal growth of uropathogenic Escherichia coli(UPEC)in urine A. 验证16种必需氨基酸合成基因缺失株的尿液生长情况(添加Ile、Met、Arg均为0.1 mmol·L-1)Recertified potential urine fitness genes by deletion mutants related with amino acids’ biosynthesis(Added 0.1 mmol·L-1Ile,Met and Arg);B. M9培养基、尿液中添加不同浓度精氨酸、蛋氨酸或异亮氨酸对各缺失株生长的影响 The supplement of arginine,methionine and isoleucine maintained the growth of indicated deletion mutant in M9 medium or urine.*P<0.05,**P<0.01. The same as follows.

2.2 氨基酸代谢失衡对大肠杆菌尿道定殖的影响

为了进一步证实精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成在UPEC感染过程中的作用,我们比较了各突变菌株在小鼠尿道竞争定殖的能力。试验结果显示:UPEC缺失argBCH、metJBL或ilvGMEDA基因,可导致精氨酸、蛋氨酸或异亮氨酸合成被阻断,显示明显的竞争定殖能力减弱,其在感染后48 h膀胱及肾脏中的定殖量下降至其1/10以下。甚至,ΔargBCH及ΔilvGMEDA在感染后48 h膀胱中的定殖量下降至其1/50左右(图2)。上述结果表明精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成是UPEC在小鼠尿道感染定殖所必需的。

图2 精氨酸(A)、异亮氨酸(B)及蛋氨酸(C)合成对大肠杆菌在尿道中定殖的影响Fig.2 The biosynthesis of arginine(A),isoleucine(B)and methionine(C)facilitated the optimal colonization of UPEC during urinary tract infectionc为UPEC菌数;图中数值为P值。c means the bacterial count of UPEC;the values in pictures mean P-value.

2.3 氨基酸代谢失衡对大肠杆菌第二信使c-di-GMP合成网络的影响

为了探求精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成障碍影响UPEC致病力的机制,我们测定了ΔilvGMEDA、ΔmetJBL及ΔargBCH在尿液中生长时各毒力因子的转录水平变化,包括菌毛、鞭毛、荚膜基因簇、铁摄取系统编码基因、黏附素合成基因以及溶血素等各类毒素合成基因。结果显示:pap及fim菌毛合成基因,以及铁摄取相关基因的转录水平由于ilvGMEDA、metJBL及argBCH的失活均表现为显著下调,下调至野毒株的1/16左右(图3)。上述结果提示,精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成障碍激活了UPEC的信号转导通路,实现对毒力因子编码基因的系统调控。

图3 ΔilvGMEDA、ΔmetJBL及ΔargBCH菌株中 重要毒力因子的转录水平变化Fig.3 The transcriptional analysis of the important virulence factors in ΔilvGMEDA,ΔmetJBL and ΔargBCH strains

研究发现,氨基酸摄取不足时,细菌容易进入氨基酸饥饿状态,从而影响许多信使小分子(包括ppGpp、sigma因子S及第二信使c-di-GMP等)的合成并调控细菌适应营养匮乏的状态进入生长平台期[25-27]。考虑到许多研究已经阐明ppGpp及sigma因子S在细菌应激过程中的调控作用机制[26,28],我们重点关注尿液中UPEC精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成障碍对第二信使 c-di-GMP体系的影响。通过全基因组生物信息学分析,我们调取了UTI89株编码的所有与c-di-GMP相关的鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)或磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDE)编码基因,测定上述基因在缺失株ΔilvGMEDA、ΔmetJBL及ΔargBCH尿液生长时的转录水平。结果显示:ilvGMEDA、metJBL及argBCH的失活普遍导致 c-di-GMP体系相关基因的转录水平下调,但是显著下调的基因在不同缺失株间存在明显不同(表2)。ΔilvGMEDA及ΔmetJBL引起的下调基因基本一致,但与ΔargBCH引起的下调基因存在明显差异。考虑到ilvGMEDA、metJBL及argBCH的失活均导致菌毛及铁摄取相关基因呈现同趋势的下调,提示上述3个缺失株应该激活了某个共同的信号转导系统。进一步分析c-di-GMP体系相关基因的转录水平,发现ycgF及yciR基因在上述 3株缺失株中均显著下调(表2),暗示可作为潜在的靶标开展后续研究。

表2 精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成障碍对UTI89株c-di-GMP体系基因转录的影响Table 2 Effect of synthesis disorders of arginine,methionine and isoleucine on gene transcription of

2.4 YciR及YcgF相关c-di-GMP体系失衡对菌毛基因簇表达的影响

YciR在其氮端及碳端分别编码了GGDEF及EAL结构域,同时发挥合成酶DGC及降解酶PDE的功能。YcgF则仅编码了EAL结构域,发挥降解酶PDE的功能。因此,要研究精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸代谢障碍导致的yciR及ycgF转录水平下降对c-di-GMP体系平衡及菌毛基因簇表达的影响。尿液培养菌株的qPCR检测结果显示,yciR及ycgF的失活导致pap及fim菌毛基因簇的转录水平下调至与ΔargBCH相似的水平(图4)。同时,ΔyciR及ΔycgF互补菌株的菌毛基因簇转录水平则恢复到与野毒株相似的水平,进一步证实上述结果的可靠性。需要注意的是,与主基因簇反向编码的papI及fimE则没有明显的转录变化(图4),表明上述下调作用主要针对pap及fim主基因簇。

图4 失活YciR及YcgF对UPEC菌毛、摄铁系统等 重要毒力因子编码基因转录的调控Fig.4 The transcriptional regulation of YciR and YcgF to the pili gene clusters and iron uptake genes

2.5 YciR下游调节子MlrA对P菌毛基因簇表达的调控作用

以往的研究证实MlrA是YciR下游一个重要的调节子[29],因此我们构建了ΔyciRΔmlrA双缺失株及它的mlrA互补菌株ΔyciRΔmlrA+mlrA。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示:在ΔargBCH及ΔyciR突变株中,papB(P菌毛基因簇代表基因)及fimB(I型菌毛基因簇代表基因)的表达量下降至野毒株的1/10左右(图5-A、B),这一结果与qPCR结果基本一致(图4)。将携带yciR的互补质粒导入ΔyciR后,papB及fimB的表达量恢复到与野毒组相似的水平。但是,YciR及其下游抑制子MlrA的同时失活仅导致papB的表达量恢复到与野毒株相似的水平,而fimB的表达量仍然与ΔyciR相当。在ΔyciRΔmlrA突变株中互补mlrA,可以使papB的表达量重新下降至野毒株的1/10左右。为了进一步明确MlrA是否直接调控pap基因簇的表达,我们进行了凝胶阻滞实验(EMSA):用PCR扩增含有潜在结合位点的启动子区域片段作为探针,以从papB编码区域扩增的片段作为阴性对照。结果如图5-C所示:MlrA融合蛋白可以和pap启动子区域结合而不能和对照片段结合,证实MlrA可以直接调控pap基因簇的转录。上述结果表明YciR通过下游抑制子MlrA直接调控pap基因簇的表达,但是其调控fim基因簇表达的接头分子需要进一步筛选分析。

图5 YciR及下游抑制子MlrA对P菌毛(papB)及I型菌毛(fimB)基因簇的转录调控作用Fig.5 The transcriptional analysis of YciR and the downstream repressor MlrA to Type P(papB) and Type I pili(fimB)gene clusters A. YciR及MlrA对P菌毛基因簇(以papB为代表)的转录调控作用The transcriptional analysis of YciR and MlrA to Type P pili gene cluster;B. YciR及MlrA对I型菌毛基因簇(以fimB为代表)的转录调控作用The transcriptional analysis of YciR and MlrA to Type I pili gene cluster;C. EMSA测定MlrA对pap启动子区域的绑定作用The identification of MlrA binding to the pap promote region using the EMSA.

2.6 YcgF下游调节子YcgE对P菌毛基因簇表达的调控作用

以往的研究证实YcgE是YcgF下游一个重要的调节子[30],因此我们构建了ΔycgFΔycgE双缺失株及它的ycgE互补菌株。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示:在ΔycgF缺失株中,papB(P菌毛基因簇代表基因)表达量与野毒株相比降低至其1/10左右(图6-A),但是fimB(I型菌毛基因簇代表基因)表达量几乎没有变化(图6-B),这一结果与qPCR结果基本一致(图4),提示YcgF仅调控pap基因簇的转录,而对fim基因簇没有作用。将携带ycgF的互补质粒导入ΔyciR后,papB的表达量恢复到与野毒组相似的水平。此外,在ΔycgF的基础上失活下游抑制子YcgE可使papB表达量恢复到与野毒株相似的水平。在ΔycgFΔycgE双缺失株中互补ycgE,可以使papB的表达量重新下调至野毒株的1/10左右。进一步的EMSA试验结果(图6-C)显示:YcgE融合蛋白可以和pap启动子区域结合而不能和对照片段结合,证实YcgE可以直接调控pap基因簇的转录。上述结果表明YcgF通过下游抑制子YcgE直接调控pap基因簇的表达,但对fim基因簇则没有调控作用。

图6 YcgF及下游抑制子YcgE对P菌毛(papB)及I型菌毛(fimB)基因簇的转录调控作用Fig.6 The transcriptional analysis of YcgE and the downstream repressor YcgF to Type P(papB) and Type I pili(fimB)gene clusters A. YcgE及YcgF对P菌毛基因簇(以papB为代表)的转录调控作用The transcriptional analysis of YcgE and YcgF to Type P pili gene cluster;B. YcgE及YcgF对I型菌毛基因簇(以fimB为代表)的转录调控作用The transcriptional analysis of YcgE and YcgF to Type I pili gene cluster;C. EMSA测定YcgE对pap启动子区域的绑定作用The identification of YcgE binding to the pap promote region using the EMSA.

3 讨论

在尿液中生长是许多引起UTI的细菌在感染初期都需要经历的阶段。当它们在尿液中生长时,不仅仅需要逃避宿主的免疫清除,还要调节自身的代谢以适应尿液的营养供给,这是它们能够成功定殖、感染并最终导致疾病发生必须具有的能力[3]。本研究首次鉴定精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成基因在UPEC尿液生长过程中发挥重要作用。事实上,尿液是一个营养物质极度匮乏的环境,自然也缺乏各类氨基酸成分[31-33],细菌必须自己合成缺乏的氨基酸以实现最优化生长。

本研究仅筛选到精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸的合成障碍造成UPEC的尿液生长缺陷,亮氨酸及脯氨酸的合成障碍只产生轻微影响,而为什么没有筛选到其他15种氨基酸合成障碍引起生长缺陷呢?首先,尿液中各种氨基酸的含量差别很大[34];其次,尿液环境中细菌对各种氨基酸的需求量也有极大差异,比如对精氨酸的需求量就比蛋氨酸和异亮氨酸多1倍;再次,本研究涉及尿液生长缺陷的氨基酸均处于合成网络的末端,其他处于合成网络中间的氨基酸往往有多条合成途径可以补救;最后,可能是由于精氨酸中磷元素及蛋氨酸中硫元素含量丰富,上述2种元素的匮乏导致其他氨基酸合成不足。

糖类等碳水化合物作为能量物质,在尿液中是不存在的。此外,尿液中也不存在蛋白质,自然各类氨基酸也极度匮乏。那么,UPEC是如何摄取足够的碳元素及氮元素来维持自己的生长及定殖的呢?UPEC在尿液中生长时可诱导多种二肽及寡肽绑定蛋白的表达显著上调,上述这2类蛋白均被证实是UPEC在膀胱及肾脏有效定殖所必需的[15],提示UPEC通过摄取尿液中微量游离的小肽促进自身生长。但是,肾脏中的营养成分与膀胱尿液中显著不同,但是很奇怪为何精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸的合成障碍却导致致病菌在上述2个脏器中的生长均受到明显限制。有文献报道,肾脏肾小球滤液的吸收过程被认为可以为UPEC提供多种利于吸收的碳源,但是UPEC引起的肾小球肾炎可以导致局部缺血而改变营养的可获得来源[35]。

除了本研究筛选到的精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成障碍菌株外,有研究证实小肽转运障碍菌株在膀胱及尿道的定殖受到明显抑制,表明细菌需要大量摄取尿液中的氨基酸或小肽,提示氨基酸或小肽是大肠杆菌尿道感染过程中最初的碳源[15]。当UPEC使用氨基酸作为碳源时,由葡萄糖异生作用合成的氨基酸,比如D-/L-丝氨酸,能够被分解为草酰乙酸盐或丙酮酸盐进入三羧酸循环,从而为葡萄糖异生作用提供基质。与尿道感染过程中细菌将氨基酸及小肽作为重要碳源一致的是,有研究发现,当UPEC在小肽转运、葡萄糖异生或三羧酸循环存在缺陷时往往显示在宿主尿道定殖的显著障碍[15,36-37]。

致病菌的感染过程是与宿主细胞不断发生相互作用的复杂过程。在不同的感染阶段,如早期需要黏附,中期需要发挥毒力促进生长、繁殖,而且需要对抗免疫系统的伤害与清除,后期可能需要休眠,造成重复感染[38]。因此,能够正确感受环境的变化,并作出恰当的反应,对于致病菌来说至关重要。感染早期需要黏附时,细菌是通过什么方式感应自身所处的环境,从而调控菌毛及黏附素等发挥作用。本研究发现UPEC的尿液生长状态对精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸合成极度敏感,提示维持上述3种处于饥饿边缘氨基酸的供应可能是细菌感应生存状态的重要媒介。氨基酸饥饿(AAS)已经被报道可以被第二信使c-di-GMP所感应[39],其不同于全局调控信号分子ppGpp仅由RelA及SpoT 2个蛋白控制,c-di-GMP由大量的合成酶DGC及降解酶PDE构成,并在菌体内局部形成稳态。外界刺激可以导致局部c-di-GMP稳态破坏,从而迅速引起个别DGC或PDE表达量的变化,促进细菌瞬息作出反应。本研究发现精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸代谢障碍可打破局部c-di-GMP稳态,导致yciR及ycgE转录水平显著下调,从而造成下游配对调节子MlrA及YcgE的抑制作用增强,进一步抑制菌毛及各类黏附素的合成。我们可以理解为,处于尿液中游离生存状态的UPEC不需要大量合成菌毛等黏附因子,而当UPEC接触到宿主细胞后可夺取对方的营养物质从而改变氨基酸饥饿状态,迅速进入促进菌毛等黏附因子合成的状态,实现黏附定殖。

总之,本研究鉴定了氨基酸代谢在UPEC引起UTI过程中的重要作用,从而更好地理解UPEC感染时氨基酸代谢与细菌定殖的关系。上述研究结果表明保障精氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸的合成,可有效促进UPEC适应宿主尿道的营养供给,实现在体内的最优化定殖。该结论可用于指导制定代谢阻断策略,抑制细菌感染的扩散(封闭细菌代谢通路上的关键蛋白和螯合感染组织中的代谢原料等),为UPEC及其相关疾病的综合防控提供依据。