谷子光敏色素家族基因的生物信息学及表达模式分析

申慧敏，吴年隆，王亚敏，王兴春

（1.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学基础部，山西 太谷 030801）

光在植物生长发育各个阶段起重要的调控作用，植物中诸如种子萌发、向光性生长、光呼吸和光合作用等生理生化现象都与其密切相关。植物通过光受体感知光信号，通过信号转导，调节基因表达，控制细胞分裂、分化与生长，最终调控器官发育和形态建成，其中，光受体在这个过程中起重要调节作用[1]。光敏色素是一类能吸收红光与远红光，且可相互转化的色素蛋白，可分为光不稳定型的类型Ⅰ光敏色素（typeⅠphytochrome，PⅠ）和光稳定型的类型Ⅱ光敏色素（typeⅡphytochrome，PⅡ），无论是单子叶植物还是双子叶植物，PⅠ由PHYA编码，PⅡ由非PHYA的光敏色素基因编码[2]。研究表明，光敏色素与植物的避阴反应和抽穗开花期相关，此外，光敏色素还参与了形态建成、诱导多种酶的合成、植物激素代谢等生理过程[3-5]。

光敏色素存在植物的各个组织中，生理作用广泛，调节植物从生长发育到衰老的形态建成。近年来，光敏色素的功能相继被解析出来。启动光敏色素信号的第1 步是通过PHYA 感知远红光或PHYB-PHYE 感知红光来改变Pr 和Pfr 的构象，光活化后，光敏色素从细胞质转移至细胞核[6-7]。激活后的光敏色素复合体与下游作用因子PIFs 和COP1-SPA相互作用[8]。PIFs是bHLH转录因子，在光敏色素介导的信号网络中起枢纽作用[9]，光敏色素与核内的PIFs 相互作用，诱导PIFs 磷酸化，并通过泛素26S 蛋白酶降解蛋白，因此，光敏色素通过降解光形态发生的负调控因子PIFs 来介导光形态发育[10]。此外，KOZUKA等[11]研究发现，光敏色素通过协调油体脂质的降解及其代谢产物糖的产生，参与去黄化过程中子叶变绿过程，在植物去黄化过程中起到关键作用。LI 等[12]研究发现，玉米中的ZMPYC1和ZMPYC2基因可调控植株开花时间和株型结构，为耐密玉米品种的选育提供了新思路和理论基础。XIN 等[13]研究发现，光敏色素信号（SFPS）剪接因子能与光受体光敏色素B 直接相互作用响应光信号，通过调控光信号AAA 传导和昼夜节律基因mRNA 前体的剪接来调节光介导的植物发育过程。

谷子（Setaria italica）是世界上最古老的驯化作物之一，与其他作物相比，其具有许多优良性状，包括抗旱、耐贫瘠，C4高光效，在旱作可持续生态农业建设中具有重要作用[14-16]。然而，鲜见有关对SiPHY基因家族成员及功能的研究报道。

本研究利用生物信息学方法鉴定分析谷子中PHY基因家族成员及其在不同光周期条件下的表达模式，有助于研究光敏色素与谷子光敏感性间的关系。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料有野生型晋谷21、黄粟、大同红谷和早熟突变体xiaomi（晋谷21 的EMS 诱变突变体）、xiaomi3（黄粟的自然诱变突变体）、xiaomi4（大同红谷的自然诱变突变体）。

1.2 试验方法

1.2.1SiPHY基因家族序列鉴定及理化性质分析从拟南芥（Arabidopsis thaliana）数据库TAIR（https://www.arabidopsis.org/）中获得5个PHY家族成员（At-PHY）的蛋白序列，在Phytozome 数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中下载水稻、高粱、玉米和狗尾草的基因组数据，在谷子多组学数据库（http://sky.sxau.edu.cn/MDSi.htm）下载谷子xiaomi的基因组数据。利用拟南芥AtPHY 蛋白序列通过Bio Edit 软件中的Local BLAST 程序筛选xiaomi、水稻、高粱、玉米和狗尾草的PHY 蛋白序列，筛选不稳定条件为E-value＜10e-10，并利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）进行结构域验证。最后利用在线网站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）对谷子SiPHY 蛋白的氨基酸数目、分子质量、等电点（PI）、不稳定系数和脂肪系数等理化性质进行预测。

1.2.2SiPHY基因家族进化分析 将1.2.1 中筛选鉴定到的谷子、拟南芥、水稻、高粱、玉米和狗尾草的PHY基因，利用MEGA 7.0 软件中的Align By Muscle 程序对6 种不同物种的PHY 家族成员的蛋白序列进行多序列比对，并采用邻接法（NJ）构建系统进化树，Bootstrap参数设置为1 000。

1.2.3SiPHY基因家族的保守结构域和基因结构分析 使用在线网站MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）预测谷子SiPHY基因的保守基序，Motif数目设置为10，然后利用TBtools 绘制xiaomiPHY家族基因的基因结构和保守基序图。

1.2.4SiPHY启动子顺式作用元件分析 在谷子多组学数据库下载谷子PHY 家族各成员的上游2 000 bp 的基因组序列，然后递交至在线网站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行启动子顺式作用元件分析；最后利用TBtools 对整理后的功能元件进行可视化操作。

1.2.5 不同光周期下SiPHY基因的表达模式分析利用谷子多组学数据库中的Expression Visualization 工具获取SiPHY基因的表达量及热图，并对其表达谱进行分析。为进一步研究在不同光周期条件下SiPHY基因的表达情况，本研究选用在长日照条件（16 h 光照，28 ℃/8 h 黑暗，22 ℃）和短日照条件（10 h 光照，14 ℃/8 h 黑暗，22 ℃）生长30 d 的野生型晋谷21、黄粟、大同红谷和早熟突变体xiaomi、xiaomi3、xiaomi4的新生叶，用荧光定量PCR（qRTPCR）的方法检测SiPHY基因的表达量。材料种植于恒温培养箱中，光照强度设置为30 000 lx，湿度设置为50%，每7 d浇一次B5营养液。

采用Omega 植物RNA 提取试剂盒R6827-01提取6个品种新生叶片的RNA，采用宝日医生物技术（北京）有限公司的反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit（货号RR047A）合成cDNA 第一链，TB Green®Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒（货号RR820A）进行实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR），3次生物学重复。15 μL反应体系包括：7.5 μL 2×Taq PCR Master Mix（含荧光染料）、10 μmol/L 上下游引物各0.6 μL、3.3 μL ddH2O 和3 μL cDNA模板。反应条件为：95 ℃2 min；95 ℃5 s，60 ℃30 s，39 个循环。RT-qPCR 引物序列信息如表1 所示。以内参基因Si9g37480为对照，该基因在谷子的11个组织中表达量稳定。利用公式2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。

表1 SiPHY实时荧光定量PCR分析引物Tab.1 SiPHY real-time fluorescence quantitative PCR analyze primers

1.3 数据分析

利用BioRad CFX Manager 软件将4个SiPHY基因的RT-qPCR 数据导入到Excel，将重复性差的数据删除，计算出各基因的平均Cq值和相对表达量，将数据整理后采用SPSS 软件进行分析，并在Excel中作图。

2 结果与分析

2.1 SiPHY基因家族的鉴定及其理化性质分析

通过同源序列比对，在谷子xiaomi的PHY家族基因包含4个基因，分别命名为：SiPHY-1、SiPHY-2、SiPHY-3和SiPHY-4，均包含PHY（PF00360）、PAS（PF00989）和GAF（PF01590）结构域，其中，PAS 和GAF形成光感受中心，能够调节发色团的装配和改变突变蛋白的光谱特性[17]，PHY结构域在调节光敏色素Pfr 形态稳定性的微调和保证正确的光谱特性、核定位、激酶活性具有重要意义[18-19]。SiPHY-1、SiPHY-3和SiPHY-4分布在9号染色体上，SiPHY-2分布在8号染色体上；cDNA长度为2 373～3 519 bp，编码790～1 172个氨基酸；分子质量在87 118.83～128 453.27 u，等电点在5.81～6.27，除SiPHY-2 外，其余3 个成员亲水性（GRAVY）均为负数，表明它们均属于酸性亲水性蛋白（表2）。

表2 SiPHY基因家族成员基本信息Tab.2 Basic information of SiPHY gene family members

2.2 谷子、水稻、拟南芥、高粱、玉米和狗尾草PHY家族基因的进化分析

为研究谷子SiPHY的进化关系，将拟南芥（5个）和水稻（3个）、高粱（3个）、狗尾草（3个）、玉米（6个）以及谷子（4个）PHY 家族基因构建系统进化树，结果如图1 所示，4 个SiPHY 分别属于PHYA、PHYB、PHYC 等3个亚族，其中，SiPHY-1和SiPHY-2属于PHYA 亚族，SiPHY-3 属于PHYB 亚族，SiPHY-4 属于PHYC 亚族，且PHYA 亚族聚为一支，PHYB 和PHYC 聚在一起。结果表明，谷子SiPHY 与狗尾草SvPHY、高粱SbPHY、玉米ZmPHY、水稻OsPHY 的亲缘关系近于与拟南芥AtPHY 的亲缘关系。这可能是因为谷子、狗尾草、水稻、高粱、玉米是单子叶禾本科植物，而拟南芥属于双子叶十字花科植物，推测植物在进化过程中PHY基因发生了生物学功能分化。

2.3 SiPHY基因家族的保守域和基因结构分析

为进一步了解谷子SiPHY家族成员的功能，对谷子SiPHY家族基因成员进行保守结构域和基因结构分析，结果如图2所示，SiPHY家族成员被分为2 个亚族，4 个SiPHY基因均为断裂基因，且基因结构均存在一定的差异。SiPHY-1和SiPHY-3含有5′端非翻译区和3′端非翻译区。SiPHY-4中间存在一段较长的内含子区域，可能在谷子生长发育中起特殊作用。

对谷子SiPHY蛋白的保守基序进行分析发现，总共鉴定了10个具有24～50个氨基酸残基的保守基序。基序Motif 1～Motif 10 存在于SiPHY-1、SiPHY-2 和SiPHY-3 中，SiPHY-4 中没有Motif 10。4 个SiPHY 家族成员Motif 的排布顺序相同且位置相近，表明谷子SiPHY基因家族成员的保守性较高，这些保守的Motif 在谷子光形态建成中提供了重要保障。

2.4 SiPHY基因家族的启动子顺式作用元件分析

为深入了解谷子SiPHY基因家族基因成员的潜在功能，利用PlantCARE数据库对启动子的顺式作用元件进行分析，结果如图3 所示，共筛选鉴定出66种顺式作用元件，主要与光响应、激素和逆境胁迫有关。其中，光响应元件包括AE-box、L-box、ATC-motif、GT1-motif、G-box、MRE、circadian 和ACE等，激素响应元件包括生长素响应元件（TGAelement、AuxRR-core）、赤霉素响应元件（GAREmotif、P-box、TATC-box）、脱落酸响应元件（ABRE）和水杨酸响应元件（TCA-element）等，此外，还包括干旱胁迫响应元件（MBS）、厌氧诱导元件（ARE）及参与防御和应激响应元件（TC-rich repeats）等。其中，SiPHY-1基因中含有的响应元件最多，有38种，SiPHY-2基因中含有的响应元件最少，有28 种，推测谷子中的PHYA 亚族中SiPHYA-1起主要作用。进一步分析发现，光响应元件在4 个谷子SiPHY家族基因成员中所占的比例最多，分别占26.32%（SiPHY-1）、21.43%（SiPHY-2）、21.21%（SiPHY-3）和18.92%（SiPHY-4）。这些结果表明，谷子SiPHY基因的表达主要受光信号的调节，在光形态建成中有重要作用，其次在抗逆胁迫中也发挥着作用。

2.5 不同光周期下SiPHY基因的表达模式分析

为探究SiPHY基因在谷子不同组织的表达模式，利用谷子多组学数据库中xiaomi的11 个组织的转录组数据绘制SiPHY基因表达热图，结果如图4 所示。除了SiPHY-2外，其余3 个SiPHY在11 个组织中均有表达。其中，SiPHY-1在萌发3 d 的种子中表达量最高，在其他10 个组织中表达量趋于一致，推测其在谷子萌发过程中发挥重要作用；SiPHY-2在11个组织中表达量均很低，在有的组织中表达量甚至为0；SiPHY-3和SiPHY-4在灌浆期的茎中表达量最高，其次在灌浆期的穗和旗叶中表达量较高，推测其在谷子灌浆期发挥重要作用。这些结果表明，光敏色素基因参与调控了谷子生长发育中的各个时期，并在种子萌发、抽穗期和灌浆期中发挥重要作用。

利用在长日照条件（LDs）和短日照条件（SDs）生长30 d 的野生型晋谷21、黄粟、大同红谷和突变体xiaomi、xiaomi3、xiaomi4的新生叶，用qRT-PCR方法分析SiPHY基因在不同光周期下的表达量，结果如图5 所示。从图5可以看出，SiPHY基因在不同光周期下的6 个谷子品种中的表达模式均有差异，SiPHY-2在6 个谷子品种中均微量表达或不表达。晋谷21 中的SiPHY-1在不同光周期下的表达量有明显差异；xiaomi、黄粟、xiaomi3中的SiPHY-4在不同光周期下的表达量有明显差异；大同红谷中的SiPHY-3在不同光周期下的表达量有明显差异。这些结果表明，光周期影响谷子光敏色素的表达，不同品种的表达模式不同，光敏色素在谷子光形态建成中的作用还需进一步探究。

3 结论与讨论

植物对光信号的感受是通过4 类光受体来实现的：感受红光和远红光的光敏色素（Phytochrome，PHY）、感受蓝光和紫外光的隐花色素（Cryptochrome，CRY）、蓝光依赖的向光蛋白（Photochopin，PHOT）和UVB 受体。光敏色素是由多基因编码，属小基因家族，不同植物体内的家族成员和拷贝数不同。拟南芥种存在PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE等5种光敏色素[20]，而在禾本科植物水稻、玉米和小麦中只存在PHYA、PHYB 和PHYC 等3 种光敏色素，不同的是水稻中的光敏色素是单拷贝，玉米为双拷贝，小麦为三拷贝[21]。而谷子基因组中只有4个光敏色素基因：PHYA（SiPHY-1和SiPHY-2）、PHYB（SiPHY-3）和PHYC（SiPHY-4）。研究发现，在拟南芥中光敏色素介导的光信号与脱落酸代谢途径相互作用，光敏色素作用因子PIFs也参与了植物激素信号转导[22]。对谷子光敏色素家族基因启动子进行顺式作用元件分析，共鉴定出66 种顺式作用元件，其中，光响应元件和激素类响应元件最多，表明谷子光敏色素受光和激素的调节。

植物光敏色素广泛存在于包括根在内的所有组织中，几乎调节植物生命周期的每个过程。其中，PHYA负责感知远红光，PHYB-PHYE参与红光介导的光形态发育[23]。PHYA对种子萌发具有促进或抑制作用，参与去黄化作用，促进开花和重置生物钟，调控根的发育，调节特化的韧皮部细胞从暗向光形态发生过渡，参与芽休眠及花的形态发生等[24]；PHYB 能与IAA14、ARF7 以及ARF9 互作，这些互作能够稳定IAA14 蛋白，抑制ARF7 和ARF19的转录活性，从而抑制黑暗诱导下胚轴不定根的形成[25]。YANG 等[26]研究发现，xiaomi早抽穗表型是由于PHYC基因第2 外显子上G→T 突变引起的。此外，PHYD与植物避阴性反应相关，PHYE与种子萌发和避阴性反应相关[27-28]。本研究发现，SiPHY-1在萌发3 d的种子中表达量最高，推测其可能与种子萌发有关；SiPHY-2在各个时期表达量均很低，推测谷子中的2个PHYA基因中SiPHY-1起主要作用；SiPHY-3在灌浆期的茎、旗叶和穗中表达量较高，推测SiPHY-3与谷子形态建成有关。SiPHY在不同光周期条件下的表达谱显示，SiPHY-1、SiPHY-3和SiPHY-4在长日照和短日照条件下都表达，不同材料的表达量有明显差异。SiPHY-1在晋谷21和大同红谷中差异显著，SiPHY-3在大同红谷中差异显著，SiPHY-4在晋谷21、xiaomi、黄粟和xiaomi4中差异显著。PHYA-2在不同材料和光周期条件下均微量表达或不表达，表明光周期参与调控光敏色素，不同材料对光敏色素的敏感性不同。光敏色素在谷子生长发育中的作用还需进一步研究。

本研究通过生物信息学的方法共鉴定出4 个SiPHYs，分布在8 号（1 个）和9 号（3 个）染色体上，均包含PHY（PF00360）、PAS（PF00989）和GAF（PF01590）结构域，与PHY 家族基因的结构域一致。不同谷子SiPHY蛋白的理化性质存在差异，但均为亲水性蛋白。谷子SiPHY 与狗尾草SvPHY 亲缘关系最近，与拟南芥AtPHY 亲缘关系最远。SiPHY启动区存在光响应元件、激素响应元件和干旱响应元件等。表达谱分析结果推测，SiPHY可能与谷子的种子萌发、形态建成和抽穗开花期有关。SiPHY表达量受光周期和基因型的影响，SiPHY-2在不同光周期和不同材料中表达量均很低或不表达，推测谷子中的2 个SiPHYA只有一个发挥作用。这些结果为之后谷子中光敏色素的研究奠定了基础，也为解析光敏色素是如何参与谷子光形态建成提出了理论依据。