超声波-纤维素酶联合辅助提取桑叶蛋白质工艺研究

傅海庆，张 滢

（1.福建农林大学金山学院饮食文化传承研究中心，福建 福州 350002；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）

桑叶作为“药食两用”的桑树（Morus alba L.）的叶片，因含有丰富的生物活性物质，如黄酮类、生物碱、多糖类、氨基酸和1-脱氧野尻霉素等[1-4]，在治疗肺气失和、清肝泻火气、解毒明双目、降“三高”、抗癌等方面具有很好的功效[4-10]。除此之外，桑叶在蛋白质方面的含量也十分丰富，引起了众多学者的关注。而植物叶蛋白质是世界上最大的可再生蛋白质资源之一，是植物组织内天然蛋白质的浓缩物，不含胆固醇，是潜在价值高的新型蛋白质资源[11-14]。植物叶蛋白质的提取不仅提高了作物的附加值，还可将农业副产物变废为宝，最大程度地合理利用资源[15]。植物叶蛋白质营养价值高、来源广，安全性和适用性高，是一类具有较高的营养价值和保健功能的蛋白质[15-16]。随着植物叶蛋白质资源的研究开发，其提取物或加工产品将广泛应用于食品、饲料、医药、农药、化妆品等领域[12]，其最为重要的意义是能有效缓解粮食危机[11，16]。目前，国内外对于植物叶蛋白质的开发研究利用较多的主要是苜蓿叶、黑麦草、烟叶、叶类蔬菜、子粒苋叶、刺槐叶及牧草叶、水生植物等，对桑叶蛋白提取利用较少[17]。桑树作为一种高蛋白植物[18]，不同桑树品种其叶片蛋白质含量为13.4~32.8g/100g，平均蛋白质含量为21.5±0.4g/100g[19]；有些桑叶品种甚至比畜禽肉所含的蛋白质量还要高，而大多数植物叶片蛋白质含量只有10%左右[17]；桑叶蛋白中的氨基酸种类较丰富而齐全，必需氨基酸含量较高，特别是其中的降压物质γ-氨基丁酸含量达到了226 mg/100 g干桑叶，且不含动物性胆固醇，是一种营养价值较高的优质植物蛋白，符合消费者对蛋白食品的要求[17，20-21]。目前，市面上与桑叶相关的产品主要有桑叶粉、桑叶茶、脱水桑叶菜、桑叶面条、桑叶豆腐、桑叶调味酱等一些初加工产品，而以蛋白质为主要成分的深加工产品应用较为少见[22-24]，这可能与桑叶蛋白质的提取工艺技术尚未满足工业应用需要有关。桑叶蛋白质的主要提取方法有水浸出法[25]、酸碱沉淀法[17]、盐析法[11，26]、超声波辅助提取法[17，27-30]、微波辅助提取法[20]、纤维素酶辅助提取法[30-31]、乳酸发酵法[11，26，32]、反胶束法[26]、纳米器件辅助法[33]等，其粗蛋白提取得率多为5.0%~10.5%。不同提取方法所依据的原理不同，故各种提取方法具有不同的提取率和优缺点[12]，但现有报道的提取率总体偏低。目前，我国桑叶的原料资源十分充足，不仅桑叶种植粗放、生产成本低廉，而且产量极高[34]，如能提高桑叶蛋白质的提取率，开发成天然保健产品或作为其他食品的原辅料成分，则其应用潜力巨大。综合应用多种提取原理，在超声波辅助提取的基础上，结合纤维素酶法进行提取，以探索桑叶蛋白质的提取方法，形成更好的提取工艺技术，为后续的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

桑叶粉（经超微粉碎工艺而得，含蛋白质20.6%），安徽奥祥堂健康产业有限公司提供；纤维素酶（10 000 U/g），南宁庞博生物工程有限公司提供；氯化钠、氢氧化钠、盐酸等，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA224S型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；JY92-IIN型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；TGL-16M型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；PB-10型pH测定仪，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；XMTE-205型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司产品；DHG-9030型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 超声波辅助提取桑叶蛋白质的工艺流程

主要工艺流程：桑叶粉→添加NaCl溶液→超声波处理→水浴浸提→离心得上清液→调节pH值使蛋白质沉淀→离心得沉淀物→干燥→粗蛋白样品。

在前人研究结果的基础上，拟定主要操作要点为：称取5 g的桑叶粉，按料液比1∶20（g∶mL）加入质量分数为0.5%的NaCl溶液，经功率为100 W的超声处理20 min后，于50℃水浴浸提40 min，以转速4 000 r/min离心15 min得上清液，调节上清液pH值3.0以沉淀蛋白质，以转速4 000 r/min离心15 min得到沉淀物，于60℃下热风干燥沉淀物至恒质量即可得到桑叶粗蛋白[17，27-30]。在研究上述不同工艺因素对蛋白质提取率的影响时，只改变该因素的水平，其他因素水平基本保持不变。

1.3.2 超声波辅助提取桑叶蛋白质单因素试验

分别从超声功率、超声处理时间、浸提温度、浸提时间、盐质量分数、料液比、沉淀时的pH值等方面进行研究，以超声波辅助法提取桑叶蛋白质的提取率为指标，研究不同因素水平对蛋白质提取率的影响，每个因素水平至少进行3次平行试验，取其平均值进行分析。

（1）超声功率对提取桑叶蛋白质提取率的影响。在提取桑叶叶蛋白的工艺流程中，分别设置超声功率为0，100，200，300，400，500 W，其他工艺参数基本不变（其中料液比为1∶25），研究超声功率对提取桑叶蛋白质提取率的影响。

（2）超声时间对提取桑叶蛋白质提取率的影响。在提取桑叶叶蛋白的工艺流程中，分别设置超声处理时间为0，10，20，30，40 min，其他工艺参数基本不变（其中料液比为1∶25，超声功率为400 W），研究超声处理时间对提取桑叶蛋白质提取率的影响。

（3）NaCl质量分数对提取桑叶蛋白质提取率的影响。在提取桑叶蛋白质的工艺流程中，分别设置NaCl溶液的质量分数为0，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%作为浸出溶剂，其他工艺参数基本不变（其中水浴浸提时间为50 min），研究NaCl质量分数对提取桑叶蛋白质提取率的影响。

（4）料液比对提取桑叶蛋白质提取率的影响。在提取桑叶蛋白质的工艺流程中，分别设置料液比为1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35进行提取，其他工艺参数基本不变（其中水浴浸提时间为30 min），研究料液比对提取桑叶蛋白质得率的影响。

（5）水浴浸提温度对提取桑叶蛋白质提取率的影响。在提取桑叶蛋白质的工艺流程中，分别设置水浴浸提温度为30，40，50，60，70℃进行试验，其他工艺参数基本不变（其中水浴浸提时间为60 min），研究水浴浸提温度对提取桑叶蛋白质提取率的影响。

（6）水浴浸提时间对提取桑叶蛋白质提取率的影响。在提取桑叶蛋白质的工艺流程中，分别设置水浴浸提时间为10，20，30，40，50，60 min，其他工艺参数基本不变，研究水浴浸提时间对提取桑叶蛋白质提取率的影响。

（7）酸沉淀pH值对提取桑叶蛋白质提取率的影响。在提取桑叶蛋白质的工艺流程中，分别设置酸沉淀pH值为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0进行试验，其他工艺参数基本不变（其中水浴浸提时间为60 min），研究酸沉淀pH值对提取桑叶蛋白质提取率的影响。

1.3.3 超声波辅助提取桑叶蛋白质正交试验

根据单因素试验结果，筛选出对提取提取率影响较大、最佳水平不确切的水浴浸提温度、超声功率、NaCl质量分数、料液比等4个重要因素作为变量，进行正交设计L9（34），进一步优化主要因素水平对桑叶蛋白质提取提取率的影响。

超声波辅助提取桑叶蛋白质的正交试验因素与水平设计见表1。

表1 超声波辅助提取桑叶蛋白质的正交试验因素与水平设计

1.3.4 超声波-纤维素酶联合辅助提取桑叶蛋白质的工艺流程

桑叶粉→添加NaCl溶液→超声处理→水浴浸提→离心得上清液→调节沉淀物的pH值→添加纤维素酶分解→离心得上清液→合并2次上清液→调节pH值使蛋白质沉淀→离心得沉淀物→干燥→粗蛋白样品。

在前述及前人的研究基础上，拟定主要操作要点为：称取5 g的桑叶粉，按料液比1∶28（g∶mL）加入质量分数为0.9%的NaCl溶液，经功率为150 W的超声处理30 min后，于50℃水浴中浸提50 min，以转速4 000 r/min离心15 min得上清液；调节沉淀物的pH值到5.0，按4%添加纤维素酶，于50℃下酶解40 min，以转速4 000 r/min离心15 min得上清液；合并2次所得上清液，调节上清液pH值到3.0以沉淀蛋白质，以转速4 000 r/min离心15 min得到沉淀物，于60℃下热风干燥沉淀物至恒质量即可得到桑叶粗蛋白[31，35]。在研究上述不同工艺因素对蛋白质提取率的影响时，只改变该因素的水平，其他因素水平基本保持不变。

1.3.5 超声波-纤维素酶联合辅助提取桑叶蛋白质的单因素试验

根据纤维素酶的产品使用说明、酶解特性及其前人的研究基础，只选择纤维素酶添加量和纤维素酶酶解时间2个方面作为重要单因素进行研究，各因素水平至少进行3次平行试验，取其平均值进行分析。

（1）酶添加量对提取桑叶蛋白质提取率的影响。在上述提取桑叶蛋白质的工艺流程中，分别设置纤维素酶的添加量为0，1%，2%，3%，4%，5%进行研究，其他因素水平基本保持不变，以研究酶添加量对提取桑叶蛋白质提取率的影响。

（2）酶分解时间对提取桑叶蛋白质提取率的影响。在上述提取桑叶蛋白质的工艺流程中，分别设置酶解时间为30，40，50，60，70，80 min进行研究，其他因素水平基本保持不变，以研究酶解时间对提取桑叶蛋白质提取率的影响。

1.3.6 超声波-纤维素酶联合辅助提取桑叶蛋白质的正交试验

结合上述单因素试验结果设计两因素三水平的正交试验L9（32），以进一步优化各因素水平。

超声波-纤维素酶联合辅助提取桑叶蛋白质的正交试验因素与水平设计见表2。

表2 超声波-纤维素酶联合辅助提取桑叶叶蛋白的正交试验因素与水平设计

1.3.7 桑叶蛋白质提取率的计算

式中：m1——所用桑叶粉质量，g；

m2——桑叶粗蛋白质质量，g。

1.3.8 数据处理方法

数据的分析及图表的绘制使用Microsoft Excel 2016、SPSS 17.0等软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助法单因素试验结果

2.1.1 不同超声功率处理对桑叶蛋白质提取率的影响

不同超声功率对桑叶蛋白质提取率的影响见图1。

超声波辅助处理可以粉碎桑叶细胞的细胞壁，有效增加桑叶蛋白质的溶出。但使用不同的超声功率处理，其效果不同。从图1可以看出，随着超声波功率的增加，桑叶蛋白质提取率总体显著增加（p＜0.05）；但是当超声功率超过200 W时，曲线的上升趋于平缓；超声功率为200~500 W时，得率差异不显著，这可能是超声波的空化作用达到一定功率时就足以破坏桑叶的细胞结构，让蛋白质溶出了，结合考虑节能，故选择以200 W进行进一步研究。

图1 不同超声功率对桑叶蛋白质提取率的影响

2.1.2 不同超声处理时间对桑叶蛋白质提取率的影响

不同超声时间对桑叶蛋白质提取率的影响见图2。

图2 不同超声时间对桑叶蛋白质提取率的影响

除了超声功率之外，超声处理时间也影响了提取桑叶蛋白质的产量。从图2可以看出，在超声功率相同的情况下，桑叶蛋白质的得率随着超声处理时间的延长而显著增加（p＜0.05），使用超声处理的前30 min曲线的斜率较大，其后趋于平缓，其中20~40 min的提取率差异不显著，结合大多数同行研究结果考虑，以选择30 min作为处理时间为宜。

2.1.3 不同NaCl质量分数对提取桑叶蛋白质提取率的影响

不同NaCl质量分数对桑叶蛋白质提取率的影响见图3。

图3 不同NaCl质量分数对桑叶蛋白质提取率的影响

蛋白质在一定质量分数范围的盐溶液中会呈现“盐溶”现象，这种现象增加了蛋白质的溶解性[36]。氯化钠溶液中的氯离子与带正电荷的蛋白质基团结合，增加了蛋白质分子之间的静电排斥力，从而提高了蛋白质的溶解性[32]。以不同的NaCl质量分数进行提取试验。

从图3可以看出，随着NaCl质量分数的增加，提取得率显著增加（p＜0.05），并在质量分数为0.8%时达到最大值。这与几位学者的研究结果有较大出入，多数选择0.3%~0.4% NaCl溶液进行提取[17，27-28]，其中原因是否与NaCl质量分数的提高还会导致核酸提取量的增加有关而选择低质量分数有待进一步研究[28]。将0.8%的NaCl质量分数作为进一步优化研究的因素和水平。

2.1.4 不同料液比对桑叶蛋白质提取率的影响

不同料液比对桑叶蛋白质提取率的影响见图4。

图4 不同料液比对桑叶蛋白质提取率的影响

综合前人研究结果，选择料液比为1∶15~1∶35时进行提取研究。经方差分析，总体提取率具有显著性差异（p＜0.05），以料液比1∶20，1∶25为相对的高点，结合大多数同行研究结果考虑，选择料液比1∶25作为进一步研究的水平。

2.1.5 不同浸提温度对桑叶蛋白质提取率的影响

不同浸提温度对桑叶蛋白质提取率的影响见图5。

图5 不同浸提温度对桑叶蛋白质提取率的影响

试验了不同水浴浸提温度对桑叶蛋白质提取率的影响。随着浸提温度的升高，桑叶蛋白质的得率也显著升高（p＜0.05），当浸提温度为50℃时，桑叶蛋白质提取率最高；浸提温度进一步升高，桑叶蛋白质提取率没有显著差异，甚至有些下降趋势，这可能是蛋白质在高温下会发生变性溶解等不良变化所致[32]。故选择50℃作为浸提温度为宜。但有学者认为在30，40℃时的提取率更高[17，30]；这有待进一步优化研究。

2.1.6 不同浸提时间对桑叶蛋白质提取率的影响

不同浸提时间对桑叶蛋白质提取率的影响见图6。

图6 不同浸提时间对桑叶蛋白质提取率的影响

试验了不同浸提时间对桑叶蛋白质提取率的影响。桑叶蛋白质提取率随着浸出时间的延长而呈显著增加趋势（p＜0.05），但超过50 min后提取率显著下降，这可能是由于加热时间过长而发生桑叶蛋白质的凝集现象，提取时与残渣一起分离造成损失所致。该浸提时间比不少学者研究的要节约不少时间，甚至可节约30 min，故以浸提时间50 min为宜。

2.1.7 不同酸沉淀pH值对提取桑叶蛋白质提取率的影响

不同酸沉淀pH值对提取桑叶蛋白质提取率的影响见图7。

图7 不同酸沉淀pH值对提取桑叶蛋白质提取率的影响

不同蛋白质有不同的等电点，需要调节不同的pH值得以沉淀。从图7可以看出，桑叶蛋白质的沉淀在pH值为2.0~4.0时，能有较高的提取率；经方差分析，总体提取率具有显著性差异（p＜0.05），而以pH值为2.0时最高，这与部分学者的研究结果一致[17，29]，故以pH值2.0为最适沉淀桑叶蛋白质的酸度。

2.2 超声波辅助法正交试验结果

在分析上述单因素试验结果基础上，优先筛选出NaCl质量分数、料液比、超声功率、水浴浸提温度等4个重要因素或与同行结果出入较大的因素作进一步的正交试验L9（34），以获得更优的参数。

超声波辅助法正交试验结果见表3。

表3 超声波辅助法正交试验结果

从极差法分析来看，各因素影响的大小为A＞C＞B＞D，即NaCl质量分数对桑叶蛋白质的提取率影响最大，其后依次是浸提温度、料液比和超声波功率；最佳因素水平应为A3B3C2D1，即以0.9%的NaCl质量分数作为浸提溶剂、料液比1∶28，超声功率150 W，浸提温度50℃为最佳参数水平，此时桑叶蛋白质提取率为9.43%。

2.3 超声波-纤维素酶联合辅助法单因素试验结果

2.3.1 纤维素酶添加量对桑叶蛋白质提取率的影响

纤维素酶添加量对桑叶蛋白质提取率的影响见图8。

图8 纤维素酶添加量对桑叶蛋白质提取率的影响

纤维素酶能分解植物细胞壁的纤维素而破坏植物细胞壁，可增加植物蛋白质的溶出。试验了纤维素酶添加量对桑叶蛋白质提取率的影响。从图8可以看出，随着酶添加量的增加，桑叶蛋白质的产量逐渐上升，总体提取率具有显著性差异（p＜0.05）；当酶添加量超过4%时，曲线的上升趋于平缓，从降低成本考虑，以4%的酶添加量为宜。

2.3.2 纤维素酶酶解时间对桑叶蛋白质提取率的影响

酶解时间对桑叶蛋白质提取率的影响见图9。

图9 酶解时间对桑叶蛋白质提取率的影响

试验了纤维素酶酶解时间对桑叶蛋白质提取率的影响。桑叶蛋白质提取率随着酶解时间的增加，呈先上升后下降的曲线，这可能是由于酶解时间太长、超过50 min时，桑叶蛋白质会发生凝集，在过滤时与残渣一起被丢弃而造成损失；总体提取得率具有显著性差异（p＜0.05）。因此，选择50 min的酶解时间是较合适的。

2.4 超声波-纤维素酶联合辅助法的正交试验结果

根据上述单因素试验结果进行了正交试验优化。从极差法分析可知，两因素影响的大小是E＞F，即纤维素酶添加量对桑叶蛋白质的提取率影响更大；当酶添加量为4.5%时，桑叶蛋白质提取率最高，可得最佳因素水平是E3F3，即纤维素酶添加量为4.5%，酶解时间为55 min时最佳，其蛋白质提取率可达16.06%，比前述只用超声波辅助提取法的得率（9.43%）提高了70.31%。

超声波-纤维素酶联合辅助法正交试验结果见表4。

表4 超声波-纤维素酶联合辅助法正交试验结果

3 结论

以桑叶粉为原料，分别研究了超声波辅助提取法和超声波-纤维素酶联合辅助提取法提取桑叶蛋白质的工艺，获得最佳的提取工艺为：称取5 g的桑叶粉，按料液比1∶28加入质量质量分数为0.9%的NaCl溶液，经功率为150 W的超声波处理30 min后，于50℃水浴浸提50 min，以转速4 000 r/min离心得上清液；调节沉淀物的pH值到5.0，按4.5%添加纤维素酶，在50℃下酶解55 min，以转速4 000 r/min离心得上清液；合并2次所得上清液，调节上清液pH值到2.0以沉淀蛋白质，以转速4 000 r/min离心得到沉淀物，干燥沉淀物后即可得到桑叶粗蛋白。按此工艺进行桑叶蛋白质的提取，其提取率可达16.06%。

对比同行报道，王桃云等人[25]采用水浸出法，在室温下，以水为浸提剂，打浆时间3 min，浸提时间4 min，料液比1∶5（g∶mL），浸提剂pH值8.0，絮凝温度75℃，调节提取液pH值为5.0，8.0，13.0得到沉淀物，在60℃干燥后即得桑叶蛋白质，其提取率为5.17%；乔璐采用0.4%的NaCl水溶液为提取溶剂，料液比为1∶30（g∶mL），400 W超声处理20 min，在40℃下浸提80 min，于pH值2~3酸沉絮凝，沉淀干燥即得桑叶蛋白，其蛋白质提取率为10.23%[17]；刘苗苗等人[27]研究了在质量分数为0.3%的NaCl，料液比为1∶35（g∶mL），超声功率为100 W，超声时间为25 min，浸提时间为55 min时的桑叶蛋白质提取率为6.01%；王芳等人[28]以0.4%的NaCl溶液为提取溶剂，料液比为1∶30，超声波400 W处理20 min，40℃水浴浸提60 min，其桑叶蛋白质得率为9.93%；殷培峰等人[29]采用料液比1∶20，超声波400 W处理20 min，50℃水浴提取70 min，pH值2沉淀，以转速4 000 r/min离心15 min，其桑叶蛋白质提取率为9.52%；朱天明[30]采用经过超微粉碎的桑叶粉为原料（100目），pH值为8.0的磷酸缓冲液为浸提剂，以超声温度30℃，超声功率100 W，料液比为1∶40条件下提取60 min，离心分离得上清液，调节上清液的pH值为4.5，沉淀100 min，离心分离得到沉淀，冷冻干燥沉淀得到桑叶叶蛋白粗提取物，其蛋白质得率为5.7%；朱天明等人[31]还研究了以桑叶粉（未超微粉碎）为原料，pH值为5.0的缓冲液为浸提剂，在最适温度50℃，料液比1∶38，加纤维素酶（10 000 U/g）量为4%条件下酶解2 h，然后将酶解液调pH值为8，放置60 min过滤，滤液调节pH值为4.5，沉淀100 min后离心得到沉淀，冷冻干燥沉淀得到桑叶叶蛋白粗提取物，其蛋白质提取率为6.5%。而试验采用超声波-纤维素酶联合辅助的浸提方法，其桑叶蛋白质提取率比单独一种辅助方法或其他方法的要高得多，至少高出56.99%，大大提高了提取得率。这可为同行及本工艺的进一步产业化研究提供参考。