噬菌体作为结核病新兴诊疗技术的研究进展

潘稚芬 张亚会 彭草云

·综述与进展·

噬菌体作为结核病新兴诊疗技术的研究进展

潘稚芬1张亚会2彭草云1

1.嘉兴市第一医院呼吸内科（嘉兴学院附属医院），浙江嘉兴 314000； 2.蚌埠医学院研究生院，安徽蚌埠 233000

噬菌体是一种通过特异性感染杀死细菌的病毒。噬菌体治疗细菌的研究已经有几十年历史，但在结核病使用中的认识有限。目前，耐药结核的流行促使分枝杆菌噬菌体在结核病的诊疗中的研究越来越多。本文通过噬菌体的特性介绍了不同分枝杆菌噬菌体对宿主的作用机制及其在临床分型中的应用，并对噬菌体在结核病诊断及药敏检测中的价值，噬菌体疗法在分枝杆菌感染中的成效等内容进行总结。同时通过展望噬菌体作为结核病新兴诊疗技术的优势与局限性，探讨其未来研究的可行重点方向。

噬菌体；分枝杆菌噬菌体；结核病；诊断和治疗

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的呼吸道传染病，由于耐药、耐多药（multi drug-resistant tuberculosis, MDR-TB）和泛耐药（extensively drug- resistant，XDR-TB）结核菌株的传播，TB已成为严重的公共卫生问题[1]。肺结核现有的诊疗技术有限，导致大量MDR-TB和XDR-TB无法获得有效治疗，因此有必要探讨结核病诊疗的新方法。噬菌体能特异性感染并裂解细菌，用于治疗细菌感染已有几十年的历史。近年来因结核耐药形势严峻，噬菌体在结核病的诊疗中的研究受到广泛重视[2]。笔者对噬菌体的特性及分枝杆菌噬菌体在结核病诊断和治疗中的应用进行综述。

1 噬菌体的结构与种类

1.1 噬菌体的一般特性

噬菌体是一种感染细菌的病毒，主要由蛋白质和核酸构成。根据不同蛋白质结构分为三类：球状、蝌蚪状和线状。根据不同的核酸特点分为四类：单链脱氧核糖核酸（single strand deoxyribonucleic acid，ssDNA）、双链脱氧核糖核酸（double stranded deoxyribonucleic acid，dsDNA）、单链核糖核酸（single strand ribonucleic acid，ssRNA）和双链核糖核酸（double stranded ribonucleic acid，dsRNA）。综合噬菌体组成可分为A～F六种类型[3]，其中，A、B、C三类为有头部的蝌蚪状蛋白质结构20面体dsDNA，A类以收缩性长尾为显著性特征，如T4噬菌体；B类为非收缩性长尾，如λ噬菌体；C类为以T3噬菌体为例的非收缩性短尾噬菌体。D、E二类为有头部的球状无尾20面体，D类为ssDNA、如ΦX174噬菌体；E类以ssRNA核酸种类为代表的MS2噬菌体、以Φ6噬菌体为代表的核酸为dsRNA；F类为仅有尾部的线状体、核酸为ssRNA，如M13噬菌体。

根据噬菌体对宿主作用的不同生命周期，分为烈性（裂解型）噬菌体和温和（溶原）噬菌体。烈性噬菌体通过一系列复制产生子代噬菌体，使宿主细胞裂解死亡；温和噬菌体则将自身脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）与宿主细胞的DNA整合实现同步复制，形成溶原菌致细菌裂解。

1.2 分枝杆菌噬菌体生物学特性

分枝杆菌噬菌体是一种专门感染分枝杆菌宿主的病毒，属尾状病毒科，尤其是肌病毒科（具有收缩尾巴）和星状病毒科（非收缩尾巴）家族，后者含有90%以上描述的分枝杆菌噬菌体，它们具有dsDNA和尾巴的二十面体头部，这类噬菌体的细菌宿主包括快生长的耻垢分枝杆菌，慢生长的结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌[4]。

2 分枝杆菌噬菌体对宿主的作用机制

Catalão等[5]发现分枝杆菌噬菌体具有不同的裂解酶组，包含细胞溶菌酶（LysinA、LysinB）和穿孔素（holin）蛋白，用于破坏分枝杆菌宿主细胞的复杂细胞膜和释放病毒子代，具有高效裂解分枝杆菌的机制。

LysinA是一种细菌内溶素，可水解细胞壁中的肽聚糖。LysinB是一种阿拉伯半乳聚糖酯酶，可特异性水解霉菌酸与肽聚糖-阿拉伯半乳聚糖复合物的连接，从而破坏分枝杆菌的细胞膜。LysinB还可以水解耻垢分枝杆菌的海藻糖二甲酸酯，降低结核分枝杆菌致病力。LysinB具有脂肪分解活性，可以水解在MTB中广泛存在的脂肪酸酯。Holin作为一种穿孔素蛋白，参与溶菌素从细胞质向质周的转移，具有控制内毒素的激活和进入细胞壁等多种作用。除裂解作为分枝杆菌死亡的主要机制外，Kortright等[6]还提出了次级机制的存在，如裂解细胞产生超氧自由基，或分枝杆菌噬菌体诱导程序性细胞死亡。此外，噬菌体还通过调节细菌细胞来刺激细菌的吞噬作用，噬菌体包裹在细菌表面，使其更易被巨噬细胞和其他先天免疫细胞识别[7]。

分枝杆菌噬菌体TM4的编码蛋白与转录调控因子相似，在单核细胞内裂解并杀死分枝杆菌。噬菌体T7是一种专溶性噬菌体，可产生与核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）聚合酶结合的小的编码蛋白质，抑制细菌基因转录，阻止MTB-RNA聚合酶的酶促活性。噬菌体P4的衣壳蛋白以两种方式抑制MTB的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶和转录基因的活性，杀死MTB。噬菌体L5的小尾蛋白通过水解分枝杆菌细胞膜表面的含糖分子达到裂菌。噬菌体PDRPv对结核分枝杆菌具有催化活性，然而确切抗结核机制尚不清楚[8]。分枝杆菌噬菌体SWU1gp39抑制分枝杆菌的脂质代谢，阻止长链脂肪酸的产生，增加细胞壁通透性；gp67下调多个基因的转录，改变菌落形成和生物膜形态，在噬菌体子代的繁殖和释放中发挥作用。此外，SWU1gp39和gp67通过增加MTB对不同抗生素的敏感性，可作为广谱抗生素的佐剂或增效剂[9]。

3 分枝杆菌噬菌体在结核病中的应用

3.1 噬菌体在临床分枝杆菌分型中的应用

自然界中噬菌体呈现出非常不同的宿主特异性，利用噬菌体宿主特异性可对临床新分类的结核菌进行分型[10]。由于分子诊断技术的发展，噬菌体分型被DNA的方法所取代[11]。目前已有29个分枝杆菌噬菌体簇[A至Z、AA、AB和AC]，其中A是最大的簇，还有16个科。12个簇进一步分为亚簇：A1至A14和A16至A20、其中A15噬菌体只感染戈登分枝杆菌株。B1至B13、C1至C2、D1至D2、F1至F5、G1至G5、H1至H2、I1至I2、K1至K7、L1至L4、M1至M3和P1至P6。随着噬菌体新序列的发现，基于整体核苷酸序列共享≥50%的基因组DNA或≥35%的基因被归属到相应的簇和亚簇组中[12]。20世纪80年代，分枝杆菌噬菌体通过基因重组工程和质粒穿梭，在分枝杆菌宿主中引入选择性免疫标志物来进行分枝杆菌属的报告分型[13]。

3.2 分枝杆菌噬菌体在结核病诊断和耐药检测中的应用

以噬菌体为基础的结核病诊断技术包括：噬菌体扩增生物学（phage amplified iologically，PhAB）检测和噬菌体报告基因检测（phage reporter assays，PRAs）。Foddai等[14]研究的PhAB技术利用噬菌体感染，扩增和破坏细胞的能力来检测临床样本中活的结核分枝杆菌。该技术目前已用于结核病的快速诊断和药物敏感性检测，与传统培养方法所需的4～8周比较，PhAB检测快速而简单，只需48h，但耐药分析的变异性较大，灵敏度81%～100%，特异性73%～100%。PhAB还具有检测溃疡分枝杆菌、鸟分枝、海分枝和龟分枝杆菌等其他非结核分枝杆菌的能力。

噬菌体报告基因检测（phage reporter assays，PRAs）的关键优势是只有当存在活的靶细胞时才会产生信号。PRAs对不同的分枝杆菌噬菌体进行工程改造，即可以检测到荧光、发光或替代信号。Allúe-Guardia等[15]将萤火虫荧光素酶基因整合到噬菌体DNA中，构建了第一代荧光素酶报告噬菌体法（luciferase reporter phage，LRP），重组噬菌体感染宿主细菌后可通过荧光显微镜观察到，如果细菌已被抗生素杀死，则不能表达产生荧光蛋白，因而在含抗结核药物培养基中短暂培养几小时内，即可动态观察杀菌效果，进行抗结核药物敏感性检测和新药的筛选。应用噬菌体Che12构建新的分枝杆菌荧光素酶报告噬菌体，可检测到休眠的结核分枝杆菌，对于诊断潜伏结核感染很有希望，该技术尚处于试验阶段，需要改进测试条件[16]。

此后，优化LRP开发了携带绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein gene，gfp）的荧光分枝杆菌噬菌体。Piuri等[17]研究该方法检测异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇等抗结核药物的敏感度、特异性更高、稳定性更好。Jain等[18]研究了纳米荧光素酶报告法，该技术可准确识别异烟肼和利福平等耐多药结核杆菌外，还可以在多耐药和泛耐药结核病方案中检测贝哒喹啉、普托马尼、利奈唑胺等药物的敏感性。随后又构建了一个双报告分枝杆菌噬菌体法，该技术可以用来鉴定和定量细胞内持留结核分枝杆菌，评价治疗效果[19]。Foddai等[20]研发的一项新技术是使用磁珠捕获杆菌，该方法检测活菌更快速、灵敏，特异性高。

3.3 分枝杆菌噬菌体在结核病治疗中的应用

3.3.1 分枝杆菌噬菌体治疗结核病的临床前研究 早期噬菌体治疗研究仅限于动物试验，仅在牛分枝杆菌或结核分枝杆菌感染的动物模型上观察。到目前为止，只有少数噬菌体的抗结核治疗潜力被研究，包括分枝杆菌噬菌体D29、DS6A、TM4、BTCU-1、SWU1和Ms6[8]。彭丽等[21]研究结果显示，菌体D29治疗敏感结核分枝杆菌株感染的豚鼠与采用利福平治疗4周后比较，效果优于单用利福平。Pedulla等[22]发现包括TM4在内的一些长尾分枝杆菌噬菌体尾部卷尺蛋白有裂解静止期结核菌作用，减少结核病复发。柳岩等[23]研究D29不能裂解静止期结核菌，但噬菌体TM4和Guol能够裂解。Azimi等[8]利用耻垢分枝杆菌传递的噬菌体TM4裂解酶可杀死细胞内结核分枝杆菌。Danelishvili等[24]的研究证实：噬菌体TM4通过载体可杀死细胞内结核和鸟分枝杆菌。噬菌体D29-LysinB对溃疡分枝杆菌的杀菌作用在小鼠模型中也得到证实，体内显示出与其他抗菌药物的协同作用，彻底消除感染部位的结核分枝杆菌[8]。Sula等[25]发现噬菌体DS6A治疗结核分枝杆菌感染的豚鼠，与最有效的抗结核药物异烟肼疗效相当。Zemskova等[26]发现DS6A噬菌体可抑制肉芽肿的形成，对血行播散性结核有治疗作用，疗效略逊于异烟肼。邬亭亭等[27]研究认为噬菌体33D为裂解型噬菌体，可杀灭休眠菌及胞内菌，直接杀灭耐药结核分枝杆菌，可作为耐药结核病“鸡尾酒疗法”的候选噬菌体配方。江莉莎等[28]研究显示，分支杆菌噬菌体Leo能杀灭结核分支杆菌。

有研究者认为3～6种具有不同抗药性的分枝杆菌噬菌体组合治疗结核病是理想的策略。Guerrero- Bustamante等[29]成功组装了一种含五种噬菌体混合物的鸡尾酒。Johansen等[30]则将噬菌体与抗生素结合使用协同杀灭病原菌。

3.3.2 分枝杆菌噬菌体给药方法、频率和剂量 噬菌体给药方法取决于结核病灶的部位，包括滴鼻剂、吸入剂、口服、皮下注射、静脉注射或脓肿内直接注射。给药频率和剂量取决于噬菌体在治疗部位维持有效的治疗浓度多长时间而没有严重的不良反应。由于噬菌体由蛋白质和DNA组成，其毒性较低，大剂量治疗除了对噬菌体衣壳蛋白有轻度过敏外，不会引起严重的不良反应。

3.3.3 分枝杆菌噬菌体在结核感染中的预防 2019年Carrigy等[31]研究足够剂量的分枝杆菌噬菌体D29雾化吸入肺部是预防结核分枝杆菌感染的一种有价值的干预措施，为高风险人群预防性治疗提供选择。

3.3.4 分枝杆菌噬菌体在耐药分枝杆菌感染中的治疗 Dedrick等[32]首次报道了噬菌体用于临床治疗的研究。1例15岁双肺移植后伴有囊性纤维化和弥散性耐药脓肿分枝杆菌感染者Isabelle，该患者对药物治疗无效，研究人员在筛选了分枝杆菌噬菌体数据库后，研发了Muddy、BPs33ΔHTH-HRM10和ZoeJΔ45三种噬菌体的混合物“鸡尾酒”，经静脉给药后患者临床症状改善，皮肤感染性损害减轻，肝功能改善，无明显不良反应。1例免疫功能正常的81岁老年男性，患有支气管扩张伴耐药脓肿分枝杆菌感染性肺病，使用同样的三噬菌体鸡尾酒静脉治疗6个月因强烈的抗体中和反应而失败[33]。而在首例Isabelle患者中至少监测了9个月未发现针对三株噬菌体的中和抗体，提示Isabelle的免疫抑制状态（肺移植后免疫抑制剂服用），可能有利于噬菌体的存活和治疗的成功。研究者还发现菌落形态（光滑或粗糙）影响噬菌体易感性，光滑的分离菌株可能具有初始耐药性[33]。

4 分枝杆菌噬菌体诊疗的展望

噬菌体的诊断只检测到活菌，而特异性是由噬菌体的宿主范围决定，具有快速诊断结核与非结核分枝杆菌及药敏检测的能力，还有检测结核潜伏感染的潜能，定量细胞内持留分枝杆菌及评价治疗效果。

噬菌体治疗耐药性细菌通常是个性化的，使用患者自己的致病菌株来筛选治疗上有效的噬菌体，用于治疗结核病的噬菌体“鸡尾酒”需要满足一些关键要求：①候选噬菌体必须同时感染结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌，以便能利用快生长的非致病性耻垢分枝杆菌菌株，安全有效地生产临床使用所需的结核分枝杆菌噬菌体；②裂解性噬菌体是首选，因为很少有细菌能在噬菌体感染中存活下来，且当没有更多的细菌宿主可接近时，噬菌体会自我消除；③温和性噬菌体整合在宿主基因组上时可以形成溶原菌，在此过程中可能会将某些不利基因转移到其他细菌中，导致宿主毒性或抗生素耐药性的增加，但温和性噬菌体可以通过基因操纵来使其转变成裂解性噬菌体，从而适合于治疗使用；④噬菌体“鸡尾酒”的组合也很重要，它不仅会感染和杀死广泛的临床分离株，且足够多样化，以减少噬菌体耐受株出现的可能性。

作为一种结核病的潜在治疗手段，噬菌体疗法仍任重道远。由于MTB独特的感染方式，噬菌体治疗最大的问题是如何进行给药，使噬菌体与细菌相互接触。未来随着科学研究的发展，基于合成生物学，基因改造后的噬菌体若能克服目前疗法中存在弊端，则有望成为治疗耐药结核病的另一法宝。

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浙江省中医药科技计划（2021ZB290）；嘉兴市科技计划项目（2022AD30065）

潘稚芬，电子信箱：597085662@qq.com

（2022–06–29）

（2022–09–15）

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