青稞真菌毒素检测分析

连 倩，贾湃湃，肖 明,，崔明明，孙小凤

（1. 青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016；2. 青海大学 农林科学院农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（西宁），青海 西宁 810016）

真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于小麦、水稻等农产品中[1]。真菌毒素污染是全球性问题，大多数国家的谷物都受到不同程度的真菌毒素的污染[2]。在欧洲，2006—2007年，意大利的翁布里亚地区玉米中 DON含量最高达14.00 mg/kg[3]。奥地利玉米中DON的检出率高达95%，其他谷类也有60%，70%的玉米同时也检出了玉米赤霉烯酮[4]。在我国，2010年12个省份的215份玉米样品中ZEN检出率为69.30%[5]。青稞是一种高原特色显著的健康食物资源[6]，它在青藏高原地区得到广泛种植，是藏族人民的基本口粮。青稞质量安全不仅与青藏高原地区的农业发展息息相关，还直接影响到人民的身体健康[7]。此外青稞还具有高蛋白质、高可溶性纤维、高维生素和低脂肪、低糖的营养结构特点[8]，因此具有很高的食疗价值[9]。因此，它的质量安全也受到广泛的关注与重视。在所有影响青稞质量的安全因子中，真菌毒素是其中的一个主要因素。由于青稞在储藏过程中时间较长，存储不当将有可能导致青稞发霉变质，产生毒素。迄今发现超过400种真菌毒素[10]，主要有黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）及伏马毒素等，这些毒素对人体具有致畸、致癌、致突变、降低免疫力和肝硬化等慢性毒性[11-12]。真菌毒素对粮食的污染不仅对人畜健康造成危害，而且有可能产生食品贸易纠纷。因此，真菌毒素在粮食中的污染问题受到世界各国和有关国际组织的高度重视。

本研究利用高效液相色谱串联质谱的检测方法，对青稞原粮中13种主要真菌毒素进行检测，以初步探明青稞产品真菌毒素等高风险产区及监管重点，为青稞的科学研究、促进生产、有效监管提供数据支撑，也为我国居民安全消费提供参考借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验材料

青稞样品共 299份：分别从青海、四川、甘肃、西藏采集，如表1所示；

表1 样品信息采集Table 1 Sample information collection 份

13种毒素标准品（纯度＞99%），伏马毒素B1（Fumonisin B1，FB1）、伏马毒素 B2（Fumonisin B2，FB2）、伏马毒素 B3（Fumonisin B3，FB3）、黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、黄曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黄曲霉毒素 G1（Aflatoxin G1，AFG1）、黄曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌稀醇（3-Acetyldeoxynivalenol，3-ADON）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌稀醇（15-Acetyldeoxynivalenol、15-ADON）、DON、雪腐镰刀菌烯醇（Nivaleno，NIV）、ZEN、T-2毒素（T-2 Toxin）：北京美正检测技术有限公司；乙腈、甲酸为色谱纯：上海安普实验科技股份有限公司产品。

1.2 仪器与设备

LCMS-8050三重四极杆液质联用仪：岛津有限公司；FLBP-200万能高速粉碎机：上海菲力博食品机械有限公司；VORTEX-5涡旋振荡器：北京海天友诚科技有限公司；H1850R离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；DC-12氮吹仪：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 真菌毒素标准溶液的配制

准确称取1 mg（精确至0.01 mg）13种标准品分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到13种浓度为100 mg/L的真菌毒素标准储备溶液，置于-20 ℃冰箱中避光保存，备用。实验中使用的单个标准工作液，均由单个标准储备液稀释得到，现用现配。

1.3.2 样品前处理

采集的青稞样品，挑出其中的石块、草根及其他植物残体，用80目的筛子筛走样品中残带的细泥沙，使用破壁机粉碎青稞，得到青稞均匀粉末，装塑封袋贴标签备用。量取5 mL乙酸，400 mL乙腈，100 mL水，混合配制成提取液。称取2.00 g样品于50 mL离心管内，加入10 mL提取液，在30 ℃下超声10 min，期间不断摇匀三次，涡旋振荡5 min至充分混匀，在10 000 r/min离心5 min，取上清液0.5 mL至离心管中，氮吹干后加提取液0.5 mL，混匀，过0.22 μm滤膜于样品瓶内，待上机。

1.3.3 色谱质谱条件

色谱条件：C18液相色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.7 μm），流动相A: 1%乙酸和5 mmol/L 乙酸铵水溶液；流动相 B:甲醇，进样量：2 μL，流速:0.3 mL/min，柱温：35 ℃。

梯度洗脱程序：0～2 min，10.0% B；3～10.5 min，20%～60% B；13.5～18.0 min，60%～75% B，18.1～22.0 min，95%～10% B。质谱条件：电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）；雾化气：氮气（99.999%）；碰撞气：氮气（99.999%）；雾化气压力：40 psi；干燥器温度：350 ℃；干燥器流量：10 L/min；毛细管电压：4 000 V。

1.3.4 真菌毒素限量规定

限量标准参照相关[13-14]。

1.4 数据分析

运用 Excel、SPSS 23. 0、Origin 2018 等软件对数据进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 青稞真菌毒素各地情况

全部样品中真菌毒素均未超标，仅检出T-2、ZEN两种真菌毒素。T-2毒素是由多种真菌，主要是三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物之一[15]。它在自然界中存在广泛，是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害较大[16-18]。如表2所示，T-2毒素在所有样品中检出率为25.75%，在青海样本中检出率为49.26%，是甘肃地区检出率的3倍；甘肃样本中检出T-2毒素检出率为16.67%；四川样本中，T-2毒素检出率为13.89 %，最高含量为68 μg/kg；西藏样本中未检出 T-2毒素。研究表明 T-2毒素在变温、高水分含量且温度在3～7 ℃条件下最适宜生长[19]。青海地区样本主要采集于门源县，门源气候湿润、水量充足且青稞黑穗病发生普遍，因此检出 T-2毒素频率较高。ZEN只有在四川和西藏两个地区检出，检出率四川地区为8.33%，最高含量为52 μg/kg；西藏地区检出率较低，为3.09%。

表2 各地区青稞毒素含量Table 2 Content of highland barley toxin in different regions

2.2 各青稞品种毒素情况

北青8号、肚里黄、昆仑14号均检出T-2毒素。黑青稞中两种毒素均检出，但含量均较低，抗逆性较强。T-2在青稞品种中分布情况如表3所示，T-2毒素在七种品种中均有检出，其中北青8号检出T-2毒素最多，肚里黄次之，昆仑14号中检出较多，其中北青8号不抗倒伏，中抗条纹病；肚里黄较抗倒伏，抗病虫害；昆仑14号抗倒伏性强，中抗条纹病及云纹病。青稞品种的抗倒伏性及抗病虫害能力影响青稞籽粒毒素的生成。倒伏发生以后，部分叶片被压倒或折损，无法获得足够的光照，影响叶片光合作用，严重时叶片会变黄甚至腐烂，如果土壤湿度大，倒伏后的植株更易滋生毒素。ZEN在青稞品种中分布情况如表4所示，ZEN毒素仅在藏青2000、当地品种及黑青稞三种青稞品种中检出，ZEN毒素在各品种中检出率均未超过2.40%。

表3 T-2在青稞品种中分布情况Table 3 T-2 distribution of highland barley varieties 份

表4 ZEN在青稞品种中分布情况Table 4 Distribution of ZEN in highland barley varieties 份

2.3 毒素在不同贮存条件中检出情况

两种毒素在不同贮存条件下检出情况如表5所示，两种毒素在农户贮存中均有检出，并且检出率在农户贮存条件下均高于在农场贮存条件下。T-2毒素在农户中检出率达33.16%，是在农场贮存中检出率的3.71倍；ZEN仅在农户贮存中检出。统计分析显示，T-2、ZEN在不同贮存条件下的检出率具有显著性差异（P＜0.05）。农场贮存青稞选择联合收割机统一收割，收割时间短，避免突遇阴雨天气，而使成熟粮含水率增加。选择粮仓储存，温度控制在10～15 ℃，相对湿度控制在65%以内，且通风条件较好；而青稞农户贮存一般为人工收割，碾场脱粒，庭院晾晒，土楼库存。中间籽粒暴露环节多，尤其库房多年使用终年没有阳光，相对阴潮，温湿度得不到很好的控制，容易滋生真菌。

表5 两种毒素在不同贮存条件下检出情况Table 5 Detection of three toxins under different storage conditions

2.4 毒素在不同收获方式下检出情况

两种毒素在不同收获方式下检出情况如表6所示，T-2在机械收获条件下检出率为 42.95%，ZEN仅在人工收获方式下检出，检出率为3.50%。统计分析显示，T-2、ZEN检出率在不同收获方式下具有显著性差异（P＜0.05）。

表6 两种毒素在不同收获方式下检出情况Table 6 Detection of three toxins under different harvest methods

3 结论

本研究在前期调研的基础上，选取四川、青海、西藏和甘肃4 个青稞种植省份作为采样点，采集了299份并分析13种真菌毒素的污染情况。结果显示，T-2、ZEN在全部样品中的检出率分别为 25.75%、2.00%，但均未超标，由此说明 T-2毒素是主要污染物，且两种毒素污染水平较低。青海主要受T-2毒素污染，检出率为49.26%，高于其他 3个省份。总体来看，4个省份青稞受真菌毒素污染水平较低。真菌毒素产生受多种因素影响，本研究分析了不同地域、不同品种、不同贮存条件及不同收获方式对真菌毒素产生的影响，研究显示不同地域，由于气候条件不一，水量充足且温湿度较高的地区受毒素污染严重；抗倒伏、抗病虫害的品种不易受毒素污染；农户贮存条件下，由于储藏条件不科学，储藏室阴暗潮湿，毒素检出较多；机械收获对青稞籽粒造成的损伤高于人工收获，因此 T-2毒素检出较高。为减轻毒素污染，应采取合理的措施进行防控，可选择抗性强青稞品种，合理灌溉，控制湿度，植株成熟后尽快收获并晾晒，尽量在通风良好的条件下储存。在后续研究中，还可继续扩大样本量，监测其他影响因素，如气候条件、土壤类型、温湿度等。目前粮食真菌毒素已引起广泛关注，国家有关部门对此高度重视，采取有效措施，妥善处理被真菌毒素污染的超标粮食，确保不用做食用用途，保障广大人民群众“舌尖上的安全”。