低共熔溶剂提取绿茶总黄酮及其抗氧化活性

倪雪华 王恒鹏

(1. 江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223001；2. 扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127)

绿茶中含有丰富的茶多酚、单宁、氨基酸、生物碱、黄酮、微量元素等活性成分，其中，黄酮类化合物作为植物的次生代谢产物，具有抗过敏、降血压、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、保肝和降血脂等活性[1-2]。目前绿茶中黄酮类物质主要通过乙醇溶液进行萃取，后续需对溶剂进行蒸发，提取率低，耗能且还会破坏黄酮的生物结构[3-5]。因此，有必要选用一种高效的绿色提取溶剂来提取绿茶中黄酮类物质。

低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents，DESs)为近年来开发的一种绿色高效提取溶剂，具有提取率高、保护活性物质、可回收与降解、安全性高、节约能耗等特点[6-7]，已被广泛应用于提取黄酮[8]、多酚[9]、皂苷[10]等植物活性成分。然而，低共熔溶剂中氢键供体和氢键受体的分子间氢键作用较强，导致低共熔溶剂黏度较高，需通过稀释或适当提高温度来降低其黏度[11]。目前，有关低共熔溶剂提取绿茶中总黄酮的研究尚未见报道。研究拟以绿茶为原料，采用低共熔溶剂对其总黄酮进行提取，分析提取溶液的抗氧化活性，旨在为绿茶相关产品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

绿茶：市售；

芦丁：HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：纯度96%，上海麦克林生化科技有限公司；

乙酰胆碱：食品级，广州华智生物科技有限公司；

乳酸：食品级，山东谦顺化工有限公司；

维生素C：食品级，维生药业(石家庄)有限公司；

甘油、无水乙醇、亚硝酸钠、尿素、草酸、氢氧化钠、硝酸铝、乙二醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

电子天平：AL204型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

高速万能粉碎机：2500Y型，永康市铂欧五金制品有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 绿茶总黄酮提取 将绿茶粉碎，过40目筛，加入一定体积的低共熔溶剂，加热搅拌，过滤，收集提取溶液。

1.2.2 绿茶总黄酮含量测定 参照文献[12]，按式(1)计算绿茶总黄酮提取率。

C=M1/M2×100%，

(1)

式中：

C——总黄酮提取率，%；

M1——提取的总黄酮质量，g；

M2——样品的质量，g。

1.2.3 单因素试验

(1) 提取溶剂种类：固定液料比(V溶剂∶m绿茶)30∶1 (mL/g)，提取温度80 ℃，提取时间60 min，考察低共熔溶剂种类[n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1，n乙酰胆碱∶n乙二醇=1∶1，n乙酰胆碱∶n甘油=1∶1，n乙酰胆碱∶n草酸=1∶1]对绿茶总黄酮提取率的影响。

(2) 液料比：固定80%乙酰胆碱—乳酸 (n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1) 水溶液，提取温度80 ℃，提取时间60 min，考察液料比[V溶剂∶m绿茶分别为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)]对绿茶总黄酮提取率的影响。

(3) 提取温度：固定80%乙酰胆碱—乳酸(n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1)水溶液，液料比(V溶剂∶m绿茶)30∶1 (mL/g)，提取时间60 min，考察提取温度(60，70，80，90，100 ℃)对绿茶总黄酮提取率的影响。

(4) 提取时间：固定80%乙酰胆碱—乳酸(n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1)水溶液，液料比(V溶剂∶m绿茶)30∶1 (mL/g)，提取温度80 ℃，考察提取时间(30，45，60，75，90 min)对绿茶总黄酮提取率的影响。

1.2.4 正交优化试验 在单因素试验基础上，以80%乙酰胆碱—乳酸(n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1)水溶液为提取溶剂，以液料比、提取温度和提取时间为自变量，以总黄酮提取率为响应值，进行正交试验设计，优化绿茶总黄酮低共熔溶剂提取工艺。

1.2.5 DPPH自由基清除能力测定 参照文献[13]，以维生素C为对照组，重复3次，按式(2)计算DPPH自由基清除率。

X=(A0-A)/A0×100%，

(2)

式中：

X——自由基清除率，%；

A0——不加入绿茶总黄酮提取液的吸光度；

A——加入绿茶总黄酮提取液的吸光度。

1.2.6 OH自由基清除能力测定 参照文献[14]，按式(2) 计算OH自由基清除率。

1.2.7 数据处理 采用正交设计助手II3.1和Excel 2016软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂种类对绿茶总黄酮提取率的影响 由图1可知，4种低共熔溶剂均可有效提取绿茶总黄酮，其中80%乙酰胆碱—乳酸(n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1)水溶液对绿茶总黄酮提取效果最佳。低共熔溶剂也被称为类离子液体，具有与离子液体类似的物理化学性质，能够快速进入绿茶细胞中将黄酮类物质溶出[15]；此外，不同浓度的低共熔溶剂水溶液可以调整低共熔溶剂的极性，使其与绿茶黄酮类物质的极性接近，利用相似相溶原理，最大程度将绿茶黄酮类物质溶出。因此，选择80%乙酰胆碱—乳酸(n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1)水溶液作为绿茶总黄酮的提取溶剂。

图1 低共熔溶剂种类对绿茶总黄酮提取率的影响

2.1.2 液料比对绿茶总黄酮提取率的影响 由图2可知，随着液料比的增加，绿茶总黄酮提取率先显著增加后趋于平衡。当液料比(V溶剂∶m绿茶)>30∶1 (mL/g)时，绿茶总黄酮提取基本完成，提取率不再升高。因此，选择液料比为30∶1 (mL/g)进行后续试验。

图2 液料比对绿茶总黄酮提取率的影响

2.1.3 提取温度对绿茶总黄酮提取率的影响 由图3可知，随着提取温度的升高，绿茶总黄酮提取率先升高后下降，当提取温度为80～90 ℃时，总黄酮提取率最大。这是因为提高提取温度有利于提取溶剂的传质，有利于绿茶黄酮类物质的溶出，此外，过高的提取温度也会导致绿茶黄酮类物质的氧化，使总黄酮提取率下降。因此，选择提取温度为80 ℃进行后续试验。

图3 提取温度对绿茶总黄酮提取率的影响

2.1.4 提取时间对绿茶总黄酮提取率的影响 由图4可知，随着提取时间的延长，绿茶总黄酮提取率先显著增加后趋于平衡。当提取时间>60 min时，绿茶总黄酮提取过程基本完成，提取率不再升高。因此，选择提取时间为60 min进行后续试验。

图4 提取时间对绿茶总黄酮提取率的影响

2.2 正交优化试验

在单因素试验基础上，以80%乙酰胆碱—乳酸(n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1) 水溶液为低共熔溶剂，以液料比、提取温度和提取时间为自变量，以绿茶总黄酮提取率为响应值，采用L9(34)进行三因素三水平正交试验设计。试验因素及水平表见表1，试验设计及结果见表2。

表1 正交试验因素及水平表

由表2可知，各因素对绿茶总黄酮提取率的影响程度依次为液料比>提取温度=提取时间，最优工艺条件为A3B3C3，即以80%乙酰胆碱—乳酸(n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1)水溶液为低共熔溶剂，液料比(V溶剂∶m绿茶)40∶1 (mL/g)，提取温度90 ℃，提取时间75 min。

表2 正交试验设计及结果

考虑到提取能耗和液料比影响提取体系总黄酮浓度问题，固定提取温度90 ℃，提取时间75 min，比较液料比(V溶剂∶m绿茶)分别为40∶1，30∶1 (mL/g)时的黄酮提取率。结果表明，当液料比(V溶剂∶m绿茶)为40∶1，30∶1 (mL/g)时，绿茶总黄酮提取率分别为(1.89±0.005)%，(1.84±0.005)%，此时提取液中总黄酮质量浓度分别为(49.6±0.26)，(65.8±0.33) mg/mL。在绿茶总黄酮提取率相差较小的情况下，考虑到提取溶液中总黄酮质量浓度影响单位体积抗氧化活性强弱，确定低共熔溶剂提取绿茶总黄酮的最优工艺条件为以60%乙酰胆碱—乳酸(n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1)水溶液为低共熔溶剂，液料比(V溶剂∶m绿茶)30∶1 (mL/g)，提取温度90 ℃，提取时间75 min，此条件下绿茶总黄酮提取率为1.84%，总黄酮质量浓度为65.8 mg/mL。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由图5可知，绿茶总黄酮提取液和维生素C对DPPH自由基的清除率均表现为随其体积的增大而逐渐提高后趋于平衡。当加入液体体积为0.04～0.12 mL时，绿茶总黄酮提取液清除DPPH自由基能力强于维生素C；当加入溶液体积>0.12 mL时，两者清除DPPH自由基能力相当，说明绿茶总黄酮提取液具有很强的清除DPPH自由基能力。

图5 加入溶液体积对DPPH自由基清除率的影响

2.3.2 OH自由基清除能力 由图6可知，稀释10后的绿茶总黄酮提取液和维生素C对OH自由基的清除率均表现为随其体积的增大而逐渐提高后趋于平衡。当加入液体体积为0.01～0.04 mL时，绿茶总黄酮提取液清除OH自由基能力强于维生素C；当加入溶液体积>0.04 mL时，两者清除OH自由基能力相当，说明绿茶总黄酮提取液具有很强的清除OH自由基能力。

图6 加入溶液体积对OH自由基清除率的影响

综上，绿茶总黄酮提取液具有很强的抗氧化活性，可能是因为低共熔溶剂中乙酰胆碱和乳酸均为食品级，不需蒸发溶剂可直接作为油脂抗氧化添加剂[16]、功能饮料食品原料[17]来源。

3 结论

试验表明，低共熔溶剂提取绿茶总黄酮的最优工艺条件为以80%乙酰胆碱—乳酸(n乙酰胆碱∶n乳酸=1∶1)水溶液为低共熔溶剂，液料比(V溶剂∶m绿茶)30∶1 (mL/g)，提取温度90 ℃，提取时间75 min，此条件下绿茶总黄酮提取率为1.84%，总黄酮质量浓度为65.8 mg/mL。抗氧化活性试验表明，一定质量浓度范围内，绿茶总黄酮提取液对DPPH自由基和OH自由基的清除能力强于维生素C，说明此绿茶总黄酮提取液具有较强的抗氧化作用，无需蒸发回收溶剂，可直接作为潜在的功能性食品原料或添加剂来源。后续应开展多种功能活性评价研究，以及绿茶总黄酮的组分分析和特性研究。此外，低共熔溶剂的活性、毒性及代谢途径有待进一步研究。