AM真菌对菌根化牡丹组培苗矿质元素吸收的影响

曾端香，王莲英

（1国家林业和草原局管理干部学院，北京 102600；2北京林业大学园林学院，北京 100083）

0 引言

牡丹(Paeonia suffruticosa)以花朵硕大、花型多姿、花色丰富而显雍容华贵、富丽端庄，被誉为“国香天色”，明清时期为国花，至今仍受国人推崇，为中国十大名花之一[1]。随着育种技术的发展，牡丹芍药组间杂交后代品种（统称Itoh杂种）优势显著，它们不仅集中了双亲的优点，而且多数品种还具有宜人的香味，被称为“牡丹芍药的未来”，组间杂交为牡丹芍药育种开创了一条新途径，所以牡丹杂交育种及胚培养技术将是解决牡丹新优品种扩繁的有效途径[2]。

组织培养已经成为园艺园林植物产业化生产的重要环节和快速繁殖苗木的主要形式。但牡丹组培中仍存在组培苗生根难、褐化和玻璃化现象严重、移栽阶段植株感病严重和死亡率高等问题[3-5]，成为牡丹组培的瓶颈。因为组织培养是在无菌条件下进行的，种苗与菌根真菌接触的机会大为减少，甚至到了苗圃驯化培育阶段也还常得不到菌根真菌的帮助，导致苗木生长状况较差，抵抗力较弱，成活率较低[6]。已有研究通过牡丹胚培养解决组培中褐化和缩短繁育周期，取得了一定进展[2,7-8]。

AM真菌（简称AMF）的主要功能之一是改善植物的矿质营养，被誉为“生物肥料”。AM真菌能显著增加植物对土壤中P、Zn、Cu的吸收，对N、K、Mg、S、Mn等的吸收也有促进作用[9-13]。不同氮肥用量条件下、小麦秸秆存在与否，AM真菌均能够改善玉米根系特性，增强氮素吸收能力，改善穗部性状，增加玉米籽粒产量[14]，接种AM真菌可以提高草莓对氮、磷、钾、钙等矿质元素的吸收，从而缓解复合盐胁迫对草莓的伤害[15]。曾端香等[16-17]研究发现AM真菌能显著改善‘凤丹’菌根化容器苗对矿质元素的吸收，3种AM真菌接种剂量均提高了‘凤丹’容器苗P、K、Ca、Mg、Fe的增长，对N、Zn的增长不明显，但降低了Mn的含量；Gg+Gm混合接种剂对N、P、Ca、Mg、Fe含量升高显著地高于其他处理。Pieriek[18]认为，向根际引入有益微生物是克服组培苗逆境胁迫的一种重要机制，尽早对组培苗进行高效菌根真菌的人工接种，实现种苗菌根化，能减轻移栽对组培苗造成的胁迫，在移栽或定植后发挥功能。

笔者对牡丹新优杂交系种子进行胚培养，得到胚根苗无菌体系，筛选胚培养最佳培养基和培养条件组合，对胚根苗进行AM真菌接种获得菌根化组培苗，探索AM真菌对牡丹组培苗生长发育和矿质元素吸收的影响，从而进一步研究AM真菌影响牡丹组培苗生长发育的作用机理，以期为AM真菌在牡丹组培中的应用和牡丹组培快繁工厂化育苗提供有效途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物材料为采自牡丹芍药育种基地（河南）的珍稀及急需扩繁保存的牡丹远缘杂交系种子，杂种系单株代号为‘Z1-10-3’（花色橘红）、‘Z1-WM’（花色红紫）。接种的AM真菌菌种由北京市农林科学院中国AM真菌种质资源库(BGC)提供；菌种1#为Glomus geosporum，BGC 507(GZ-01)；菌 种 2#为Glomus mosseae，BGC(XJ-01)。

1.2 试验方法

1.2.1 牡丹组培苗瓶内接种AM真菌试验 采用董昌金[19]的差别灭菌法进行AMF孢子表面灭菌，然后分别对牡丹组培苗进行瓶内接种AMF。每瓶接种4～6个孢子，每处理15～20瓶，重复3次；以不接种AM真菌为对照(CK)。每周观察统计1次AM真菌孢子侵染、萌发情况，以及组培苗生长情况。

1.2.2 牡丹胚根苗AM真菌侵染指标测定和菌根结构观测

（1）墨水醋染色法制片。①固定取根。洗净，将根剪成1 cm长根段，FAA(formation glacial ascetic and ethand)液固定。②透明。洗去FAA液，将根放在10%的KOH中，水浴锅90℃加热1 h，或30～32℃室温（恒温箱）放置；倒去KOH，清水漂洗数次，至水中不呈黄色。③软化。清洗后的根中加入碱性双氧水，室温下至根软化；倒去碱性双氧水，清水漂洗（较老和深色根系采用此步骤；幼嫩根系此步骤可省去）。④染色。透明后用墨水醋在电热板上煮开3 min染色。⑤脱色。用自来水（加几滴醋酸化）冲洗至少20 min；⑥制片。将小塑料瓶中染色、分色后的根段倒入培养皿中，将根段分散均匀，随机选取30条根段，分别排放在载玻片上，滴加30%的甘油1滴，加盖盖玻片。

（2）观测。在Olympus显微镜100～400倍下观察各制片中根段菌根的侵染情况，根据每条根系菌根结构按表1分级标准记录。

表1 菌根侵染分级标准

（3）计算。菌根侵染率(F)计算如式(1)，菌根侵染强度(M)计算如式(2)。

式中，n5表示5级侵染的根段数，n4表示4级侵染的根段数，n3表示3级侵染的根段数，以此类推。

1.2.3 牡丹菌根化组培苗矿质营养元素的测定 全N采用凯氏定氮法测定，全P采用钒钼黄比色法测定，K、Ca、Mg、Zn、Cu、Mn等矿质元素采用原子吸收光谱法测定。

1.2.4 数据统计分析 采用DPS专业版统计软件进行数据统计和分析，并采用Duncan进行多重比较，采用SPSS 21进行方差分析、Excel 2019进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 接种AM真菌牡丹胚培养胚根苗菌根侵染情况

由表2可知，‘Z1-WM’、‘Z1-10-3’组培苗瓶内接种AM真菌均能实现侵染，而未接种的对照均没有侵染；对于‘Z1-WM’，Gg+Gm的侵染率(95.96%)和侵染强度(33.33)极显著(P=0.01)高于单一接种剂Gg、Gm和CK，Gg的侵染率(90.78%)和侵染强度(28.45)极显著大于Gm和CK。对于‘Z1-10-3’，Gg+Gm的混合孢子接种的侵染率(93.12%)极显著(P=0.01)高于单一接种剂Gg和Gm，同时Gm的侵染率(89.87%)极显著(P=0.01)高于Gg的侵染率(65.45%)；Gg+Gm的侵染强度最高为31.23，但与Gm之间没有显著差异，但均极显著高于Gg和对照。不同品种对接种AM真菌的侵染反应不同，这与菌根真菌对宿主植物具有一定的选择性有关[9]。

表2 瓶内接种不同种类的AMF对杂交系牡丹组培苗菌根侵染统计分析

2.2 AM真菌对牡丹组培苗矿质元素N、P、K吸收的影响

图1表明，AM真菌接种剂对牡丹‘Z1-10-3’的矿质元素N、P、K的相对含量值均比对照有显著提高，以P的含量增幅最大，Gg+Gm、Gg和Gm处理的P含量分别是对照的1.634、1.582、1.272倍；其次是K的含量，其变化趋势与N含量变化趋势一致，增幅略高于N含量。

图1 AMF对牡丹‘Z1-10-3’组培苗矿质元素N、P、K相对含量的影响

不同种类的AM真菌接种剂对牡丹组培苗N、P、K含量的影响效果不同，接种Gg+Gm的组培苗的N含量是对照CK的1.472倍，显著高于单一接种剂Gg和Gm，但这两者之间没有显著差异；P含量是对照CK的1.634倍，显著高于Gm处理，但与Gg处理之间没有显著差异；K含量是对照CK的1.473倍，显著高于Gg。Gg处理的N、P、K含量与对照相比增长率分别为29.2%、58.2%、38.0%。Gm处理的N、P、K含量与对照相比增长率分别为34.0%、27.2%、45.3%。AM真菌改善了牡丹组培苗的N、P、K的吸收，从而提高了其生长量，与生长量的提高呈现正相关。

研究表明，AM真菌可以通过合成谷氨酰胺的途径同化NH4+，为根外菌丝直接吸收铵提供了依据，从而促进了N的吸收；菌根菌丝能够吸收和利用NH4+-N[20]；Ho 等[21]发现，Glomus mosseae的孢子能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，而且菌根植物地上部和根系中硝态氮还原酶的数量和活性都较无菌根植物高，说明菌根植物有同化利用硝酸盐的能力。AM真菌庞大的菌丝网在吸收养分的同时也吸收和储存了水分，它将根际土壤中的磷和其他矿质元素、水分等吸收传递给宿主植物，从而达到互惠共生关系，菌根促进植物生长，它能增加难移动养分特别是磷的吸收。

2.3 AM真菌对牡丹组培苗矿质元素Ca、Mg吸收的影响

从图2可知，Gg+Gm显著提高了牡丹‘Z1-10-3’组培苗的Ca含量，是对照的1.21倍，显著高于Gg和CK，但与Gm处理之间没有显著差异，Gg对Ca含量增加亦不显著。AM真菌降低了Mg的含量，以混合接种剂Gg+Gm降低的幅度最小，但与单一接种剂Gg、Gm之间没有显著性差异。

图2 AMF对牡丹‘Z1-10-3’组培苗矿质元素Ca、Mg相对含量的影响

有研究表明，苹果幼苗接种AM真菌首先提高了根K、Ca和Mg的含量，随后地上部分这些元素的含量也显著高于对照[22]。凡是发生矮化的桃树，其菌根发育极差，叶片的K、Ca和Mg水平也低。但也有研究者指出，AM真菌不影响植物体内Ca和Mg的含量甚至降低这些元素的含量。Granger[23]将苹果钻木组培苗即试管苗接种Glomus versiforme，对叶片的Ca、Mg和Zn含量无影响。Bartschi比较了葡萄菌根根系与非菌根根皮层细胞内矿质元素的分布，认为菌根真菌对K、Mg、Ca和Na的影响极小[9]。

AM真菌对植物的Ca和Mg含量影响不一致的原因可能是试验的立地条件、AM真菌与植物种类的不同以及大多数分析结果来自植物不同器官。事实上，菌丝吸收的矿质养分只有通过真菌-根表面，从菌丝体进入到寄主植物根部再从根部运输到地上部，才能对寄主植物的营养状况和植株生长产生促进作用[9]。

2.4 AM真菌对牡丹组培苗矿质元素Fe、Mn和Zn吸收的影响

图3反映了AM真菌对牡丹组培苗的Fe、Mn和Zn含量的变化规律。AM真菌显著提高了Fe的含量，接种Gg+Gm的牡丹组培苗Fe含量是对照的1.312倍，高于单一接种剂，Gg和Gm处理的Fe含量分别是对照的1.263和1.250倍，但三者间无显著差异；不同的AM真菌处理的Zn含量基本保持略微有所增加，但差异不显著；AM真菌却显著地降低了Mn的含量。

图3 AMF对牡丹‘Z1-10-3’组培苗矿质元素Fe、Mn和Zn相对含量的影响

AM真菌对植物矿质元素的吸收、利用与土壤中的P、Cu、Zn等元素存在着一定的相互关系，在含磷量过多的土壤里植物吸收的Cu和Zn反而减少，甚至会出现缺素症状，可能由于P的含量大量增加导致了Zn的增长不明显，一般以土壤含磷量中等水平下的AM真菌吸收Cu、Zn等微量元素最高[24]。AM真菌对土壤中因重金属的存在而形成对植物的危害也具有明显的抗御能力，在介质中重金属过量的情况下AM真菌的侵染常能减少宿主对其吸收，从而增强植物的抗性。研究表明，真菌能减轻植物在重金属上壤中的受害程度，在Mn含量高出15倍的土壤中接种AM真菌后，不但提高了植物对Mn的抗性，而且促进了植物的生长，菌根具有较强的络合重金属能力，当上壤中重金属含量过高时菌根可增强宿主植物对这些重金属离子的耐受性，从而减轻植物遭受重金属污染的程度[25-26]。

研究结果表明，对牡丹组培苗而言，矿质元素Zn、Mg和Mn的含量与生长规律并不完全一致，即营养生长较好，部分矿质元素含量不一定高，可能原因包括：（1）随着生长量的增加，由于“稀释效应”使其部分矿质元素浓度持平或呈下降趋势；（2）对部分矿质元素，不同菌种的敏感性不同；（3）某些矿质元素间可能存在拮抗作用[27]。

3 结论与讨论

AM真菌能显著促进牡丹菌根化组培苗的生长与发育，研究发现对杂交系牡丹胚培养的胚根苗在瓶内接种3种不同的AM真菌，其侵染率和侵染强度均具有显著的影响，这为牡丹菌根化苗的培养提供了参考依据。

AM真菌显著提高了牡丹组培苗的N、P、K的含量，其中以Gg+Gm混合接种剂增效作用最强。接种Gg+Gm的N含量比对照增长了47.2%，P含量比对照增长了63.4%，K含量比对照增长了47.3%；Gg处理的N、P、K的增长率分别为29.2%、58.2%和38.0%；而Gm处理的N、P、K的增长率分别为34.0%、27.2%和45.3%。与文纪銮等[28]对组培非洲菊幼苗接种Glomus属菌种以后，菌根苗根部含P量高，接种Glomus etuncatum的枝条K含量明显增加一致。AM真菌显著提高了牡丹组培苗Ca、Fe的含量，对Zn的增加不明显，保持略微有所增加，但降低了Mg、Mn的含量。

本研究发现3种不同的AM真菌接种剂均显著地促进了牡丹组培苗的矿质元素N、P、K、Ca、Fe的吸收。Gnekow等[29]研究发现AM真菌能显著增加兰科、杜鹃科植物对土壤中P、Zn、Cu的吸收，对N、K、S、Mg等的吸收也有一定的促进作用，本研究结果与其有一致的地方，但与其中AM真菌对Mg、Mn元素的作用结论相反，接种AM真菌降低了牡丹组培苗对Mg、Mn的吸收。

对于AM真菌的作用机理，有研究认为通过改变宿主植株的根系形态和菌丝网络的形成，扩大植株对养分吸收范围；释放有机酸、磷酸酶和质子等根系分泌物改变土壤结构和理化性质，与根际微生物共同作用降解土壤中难溶性磷酸盐；诱导相关磷转运蛋白基因的特异性表达，提高植株对磷的转运能力而促进其吸收[30]。由于P在土壤中移动性较小，磷酸盐扩散较慢，而根毛长度一般不超过1 mm，因此，一般植物根际磷亏缺区小于2 mm，而菌丝可以伸展到根外8 cm的空间吸收磷，这是宿主植物的根所无法达到的；而丛枝真菌菌丝可以从土壤溶液中直接吸收磷酸盐离子，并提供给宿主植物。钾是植物需量最大的元素之一，在土壤中的移动性虽比磷强，但在一般生长条件下往往在根吸收的周围能很快形成一个亏缺区，土壤供钾水平不能满足植物生长的需要时菌丝可以到钾亏缺区外吸收根系吸收不到的钾并运输给植物，对改善植物的钾营养有一定作用[31]。未来可以扩大牡丹供试区域品种，深化AM真菌机理研究。