西瓜新炭疽病病原菌分子鉴定及其生物学特性初探

黄 蔚，崔丽红，谢王超，肖国强

（1湘西民族职业技术学院，湖南湘西 416000；2永顺县高坪乡农技和农村合作经济服务站，湖南永顺 416000）

0 引言

西瓜炭疽病是西瓜栽培中的重要病害，保护地、露地均普遍发生。近10年来，随着国家扶贫力度的加大，湖南湘西自治州西瓜产业发展迅速，但同时西瓜炭疽病病害也日趋严重。据笔者2016—2018年连续3年田间调查，湘西自治州每年西瓜种植地炭疽病发病率高达40%～60%，特别是重茬地，达100%，经济损失高达50%。目前，国内外对西瓜炭疽病的研究多集中在病害发生规律和致病性方面，多采用形态学和田间观察的方法进行分类鉴定，普遍认为瓜类炭疽病(Colletorichum orbiculare)是引起西瓜炭疽病的致病菌[1-3]。但2018年笔者从湘西民族职业技术学院科技园里采集西瓜炭疽病病叶中，首次发现炭疽属的胶孢炭疽病也可使西瓜致病。为探究其对西瓜的致病机理，对其进行生物学特性研究和初探，旨在为其引起的病害提供防治依据。

1 材料与方法

1.1 病样采集

西瓜炭疽病标样2019年7月采于湖南省吉首市湘西职院科技园西瓜试验地内（原作物为黄桃），品种‘早春红玉’。

1.2 病原菌分离纯化

将所采集的病叶先用自来水冲洗干净，再用8‰次氯酸钠浸泡3 min，无菌水冲洗3遍。吸干水分后，再用已灭菌的剪刀剪取病叶病健交界处1 cm×1 cm的小片，而后置于PDA平板上，放于28℃的恒温箱中培养。3天后挑取菌落边缘的白色菌丝再次培养。待7天后菌落较大时用打孔器（已灭菌）打取Φ=6 mm的菌块，放入50%甘油（已灭菌），于-80℃的超低冰箱保存，以供生物学研究和18S rDNA-ITS分子鉴定[4]。

1.3 病害症状描述

于2019年7月采集西瓜炭疽病病叶时观察记载其田间危害症状。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 病原菌形态特征观察 将纯化后的C913病原菌菌株接种于PDA平板，28℃恒温培养，7天后采用十字交叉法测量菌块直径。待15天产孢后，采用Neubauer血球计数法测量其大小和数量，并在电子显微镜下其观察分生孢子形态。

1.4.2 柯赫氏法则验证 采集健康的‘早春红玉’西瓜叶片，先用水冲洗3～5 min，自然干后用75%酒精表面消毒30 s，无菌水清洗3次，而后将已灭菌的药棉包扎叶柄处。以水琼脂为对照，用无菌打孔器(Φ=6 mm)打取C913菌株菌块10片以备用。

用一次性针头(Φ=1.2 mm)将西瓜叶片背面划伤，然后将已打取好的C913菌块接种到叶片上，每叶片接种1处，共接种10片。而后置于L//D=16 h//8 h、白天35℃/黑暗25℃、湿度为90%的人工气候箱中，3天后观察叶片发病症状并测量病斑直径。

1.4.3 病原菌18r DNA-ITS序列分析及进化树构建 采用真菌通用引物NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS6(5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’)对病原菌的ITS和5.818S rDNA进行PCR扩增。反应体系25μL：0.5μLTemplate（基因组DNA20～50ng/μL），2.5 μL 10×Buffer(withMg2+)，1 μLdNTP（各2.5mmol/L），0.2 μLTaq酶 ，0.5 μL F(10 μmol/L)，0.5 μL R(10 μmol/L)，19.3 μL ddH2O。扩增程序：94℃预变性4 min；94℃变性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，30 个循环；72℃修复延伸10 min，最终4℃终止反应。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果在GenBank的Nr数据库进行Blast比对分析，提取比对结果中前86株菌的18S rDNA序列，用Mage 7.0分析自带的Clustal W程序进行序列比对，将结果采用邻接法(neighbourjoining，N-J)构建系统发育树。替换模型选择Kimura 2-parameter model，Bootstrap replications设置为1000。

1.4.4 病原菌对桃、梨的致病性鉴定 采集试验地旁边健康的桃叶（品种‘黄桃’）、梨叶（品种‘金秋梨’）。致病性鉴定同1.4.2。

1.5 病菌生物学特性测定

1.5.1 温度对C913菌丝生长和产孢量的影响 用灭菌过的打孔器(Φ=6 mm)打取菌块，置于PDA培养基，设置10、15、20、25、28、34、37℃共7个温度梯度。采用1.4.1的方法测定记录病菌菌落直径和产孢量。28℃恒温培养，每处理5次重复，7天后采用1.4.1的方法测定记录病菌菌落直径和产孢量。

1.5.2 pH对C913菌丝生长和产孢量的影响 用灭菌过的打孔器(Φ=6 mm)打取菌块，置于PDA培养基，设置pH 5、6、7、8、9、10、11共7个梯度。采用1.4.1的方法测定记录病菌菌落直径和产孢量。28℃恒温培养，每处理5次重复，7天后采用1.4.1的方法测定记录病菌菌落直径和产量孢。

1.5.3 碳源、氮源对C913菌丝生长的影响 以水琼脂为对照，Czapek为基础培养基，配制碳源培养基时分别将Czapek中的蔗糖等量替换为乳糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘露醇；配制氮源培养基时分别用谷氨酸、蛋白胨、甘氨酸、(NH4)2SO4等量替换Czapek中的NaNO3。每处理5次重复。28℃恒温培养，7天后用直尺测量菌落直径大小[5-7]。

2 结果与分析

2.1 病害症状描述

该病危害西瓜叶片时，开始出现水渍状小斑点，后逐渐为褐色病斑，大小不一的近圆形或不规则病斑，边缘有明显的淡黄色晕圈包围病斑，后期病斑从中心凹陷直至穿透（图1）。发病严重且空气湿度较大时，在西瓜叶病斑背面附有橘红色孢子。

图1 西瓜炭疽病病叶症状（田间采集）

2.2 病原菌鉴定结果

2.2.1 病原菌形态特征 在PDA平板上培养5天后，该病原菌菌落呈圆形，菌丝绒毛状（图2），排列整齐，初为白色，后渐为灰白色。15天后，以菌落为中心，轮状排列分生孢子盘，并有橘红色分生孢子团（图3）。圆柱形分生孢子，两端钝圆，单胞，中间有隔，大小(9.8～17.5)μm× (4.5～5.9)μm（图4）。参照《真菌鉴定手册》[8]及《植物病原真菌学》[9]，鉴定C913原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloesporioides。

图2 C913菌落（正面）

图3 C913分生孢子团

图4 C913病原菌分生孢子显微形态特征

2.2.2 柯赫氏法则证病结果 采用刺伤接种法，将分离纯化法得到的C913病原菌接种到健康的西瓜叶片上后，发现接种叶片所发病症与各自在田间的病片一致，接种部位先有近圆形的褐色小斑点出现，后逐渐扩大且有少许白色粉状物出现，7天后有明显的橘红色孢子（图5）。表明分离的真菌符合柯赫氏法则，即所得真菌是西瓜炭疽病的病原菌。

图5 C913病原菌接种西瓜离体叶片7天后症状

2.2.3 病原菌18S rDNA-ITS序列分析测定 经1.7%琼脂糖凝胶电泳，利用真菌18S rDNA通用引物NS1/NS6，进行PCR扩增，获得长度约为1300 bp的片段（如图6所示）。将获得的序列测序并上传到NCBI进行BLAST比对，发现菌株C913的18S rDNA序列与GenBank中收录的胶孢炭疽菌（登录号分别为MT763957.1、AJ391908.1、DQ916151.1和MK299420.1）相似性达到100%。系统发育树表明，菌株C913与亲缘关系最近的4株菌均为Colletotrichumsp.，其中2株为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides且处于同一个大的分支，而与炭疽菌属内其他真菌的遗传关系较远（图7）。18S rDNA系统进化树结果表明，菌株C913很可能为胶孢炭疽菌[10]。

图6 C913病原菌的18S rDNA序列PCR扩增产物电泳图

图7 C913菌株的18S rDNA序列的系统发育进化树

2.2.4 病原菌对桃、梨的致病性鉴定 将分离纯化法得到的C913病原菌采用刺伤接种法接种到健康的桃、梨叶片上（L//D=16 h//8 h，白天35℃/黑暗25℃，湿度为90%的人工气候箱中）。发现接种叶片所发病症与各自在田间的病症一致，接种后2天桃叶片病斑8 mm、梨叶片病斑10 mm，且病斑上均有少量白色粉状物，接种4天后病斑明显扩大，并伴有明显的橘红色孢子（图8）。说明从西瓜病叶上分离出的胶孢炭疽病菌C913不仅可使桃致病，也可使梨致病。这可能是西瓜地旁边种植的桃叶或梨叶受胶孢炭疽病侵害后，其孢子飘到西瓜叶上，导致西瓜产生了病害，也有可能是原有试验地所栽的桃残留下来的胶孢炭疽病引起的病害。

图8 桃离体叶片接C913后4天（左）和梨离体叶片接种C913后4天（右）的症状

2.3 病菌生物学特性测定结果

2.3.1 温度对C913菌丝生长、产孢量的影响 试验结果表明，温度对C913胶孢炭疽菌的菌丝生长和产孢量影响明显（图9）。其菌丝在温度为10～37℃时均能生长正常，但25℃时菌丝生长速度最快，菌落直径为78.28 mm，其次为28℃，菌落直径为71.60 mm，而小于10℃或大于37℃时较慢。温度28℃时C913产孢量最多，其次为25℃和31℃，而小于20℃或大于34℃时不产孢。这表明C913菌丝生长、孢子生长最适温度分别为20～31、25～31℃。

图9 不同温度对C913菌株生长和产孢量的影响

2.3.2 pH对C913菌丝生长、产孢量的影响 试验结果表明，pH的大小对C913胶孢炭疽菌的菌丝生长和产孢量影响明显（图10），菌丝孢子在pH 5～11条件下均能生长，其中，pH 6时菌丝生长最快，菌落直径最大，为84.62 mm，但与pH 7～10时的菌丝生长相差不大，表明C913胶孢炭疽菌的菌丝最适pH 6～10；pH 9时，C913胶孢炭疽菌的产孢量最多，为2.285×107个/皿，明显高于其他pH的产孢量，这表明C913胶孢炭疽菌的产孢最适为pH 9。

图10 不同pH培养基对C913菌株菌丝生长和产孢量的影响

2.3.3 碳源、氮源对C913胶孢炭疽菌菌丝生长的影响从表1可知，碳源、氮源对C913胶孢炭疽菌的菌丝生长影响较大（表1）。其中，以葡萄糖、蔗糖作为碳源培养基，其菌落直径极显著高于其他处理，分别为63.4、62.2 mm；甘露醇、果糖、麦芽糖也显著高于对照琼脂，菌落直径分别为57.5、60.9、52.7 mm，而乳糖明显不利于其菌丝生长 (P＜0.01)，为 33.1 mm，比对照少19.06%。蛋白胨作为氮源极显著高于其他氮源，菌落直径为65.5 mm，其次为硝酸钠，菌落直径为52.9 mm，而硫酸铵对菌丝生长有抑制作用，其菌落直径依次为蛋白胨＞NaNO3＞甘氨酸＞谷氨酸＞琼脂＞(NH4)2SO4。

表1 不同碳源、氮源对C913胶孢炭疽菌菌丝生长的影响

3 讨论与结论

西瓜炭疽病是全球西瓜产区普遍发生的病害，其研究主要为形态学和致病性鉴定。唐建辉[1]、唐爽爽[2]、罗婷[3]、Jenkins[11]等的研究结果表明，西瓜炭疽病致病菌为瓜类炭疽菌(Colletorichum orbiculare)。本试验通过田间观察，结合室内孢子形态观察和18S rDNA-ITS测序结果，确定所采集的西瓜炭疽病病叶致病菌为胶孢炭疽病。将该菌株离体接种至桃、梨叶片，发现能同时使桃叶、梨叶致病。这说明C913不仅可使西瓜发病，也可使桃梨发病，这是国内外研究者所没有报道过的。关于胶孢炭疽病，前人研究较多，如胡永亮[12]研究表明胶孢炭疽病是铁皮石斛炭疽病的致病菌。余凤玉[5]认为胶孢炭疽病是春羽叶斑病的致病菌。李河[13]通过形态学观察和ITS-CAL-GAPDH序列分析，认为油茶炭疽病除胶孢炭疽病外，还有其他病菌。本试验中所采集的病叶，致病菌可能与环境有关，因为此地原为黄桃的种植地，后改为西瓜试验地，有可能是残留的黄桃胶孢炭疽病引起的。同时，西瓜病叶采集时间为7月初，此时试验地周边的桃、梨叶片受到胶孢炭疽病的危害较重，也有可能是其孢子飘到了西瓜叶片上导致了西瓜炭疽病。

本试验结果表明，胶孢炭疽病能使西瓜产生病害，所分离得到的菌株C913菌丝生长最适温度为20～31℃，孢子生长最适温度为25～31℃。在pH 5～11条件菌丝孢子均能生长，pH 6时菌丝生长最好，pH 9时最适产孢。C913胶孢炭疽菌对不同碳源的利用能力不同，其中以葡萄糖、蔗糖为碳源培养基培养的菌落直径极显著高于其他碳源，而以乳糖为碳源培养基培养的菌落直径明显不利于菌丝生长(P＜0.01)，比对照少19.06%。以蛋白胨为氮源培养基培养的菌落直径极显著高于其他氮源，而以硫酸铵为氮源培养基培养的菌落直径对菌丝生长有抑制作用，其菌落直径依次为蛋白胨＞NaNO3＞甘氨酸＞谷氨酸＞琼脂＞(NH4)2SO4。

本研究病原的采集范围较窄，材料仅来源于试验基地，其他种植地区尚未进行，且病原材料仅限于西瓜病叶，缺少西瓜蔓和果实材料的研究。对所得的C913菌株仅进行了形态学观察、18S rDNA-ITS分子鉴定和生物学特性初探。下一步将继续扩大病原材料鉴定范围和病原的组织部位，继续探究其致病机理，以期为西瓜炭疽病的防控及抗性育种提供理论依据。