地塞米松诱导的人小梁网基因表达谱变化及生物信息学分析

彭 毅，周文君，邓 军

0引言

糖皮质激素(glucocorticoid，GC)因其具有有效的抗炎和抗免疫作用而被广泛应用于各种全身性及眼部疾病，但长期大量使用糖皮质激素可对全身及眼部产生多种副作用。人眼是GC重要的靶器官，局部和全身使用GC都有使眼内压增高的风险，诱发激素性青光眼(glucocorticoid-induced glaucoma, GIG)[1]。GC通过与糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)结合而发挥其药物学作用。研究显示，在原位和体外培养的小梁细胞内均有GR的表达，长期使用GC可导致小梁网超微结构重塑和小梁网功能异常，进而引起房水流出阻力增加，最终导致眼内压的升高[2-3]。但GC诱发小梁网结构和功能改变的这一生物过程中所涉及的具体致病分子和通路仍不清楚。

随着高通量基因芯片和测序技术的发展，基于基因表达谱数据的生物信息学分析能高效挖掘、筛选与疾病发生发展相关的重要基因和通路。本研究基于公共基因芯片数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)中的基因表达数据，利用生物信息学方法分析地塞米松诱导的人小梁网基因表达谱变化，筛选其差异表达的基因，找到关键致病基因及通路，为GIG的分子机制研究提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料数据收集和处理：从美国国立生物技术信息中心(NCBI)平台下的基因表达综合数据库GEO (http://www.ncbi.nlm.gov/geo/)获取基因表达数据集GSE37474。芯片信息：Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，平台是GPL570。该数据集包含5个实验样本和5个对照样本(5对配对供体眼)，所有样本均来自当地眼库。实验样本处理：供体眼的眼前段组织在含有地塞米松的培养液培养10d。对照样本处理：供体眼的眼前段组织在不含地塞米松的培养液培养10d。10d后小梁网组织被切除下来用于提取RNA。

1.2方法

1.2.1差异表达基因筛选GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是一个基于R语言的Web数据分析工具，可对GEO数据集中两组或多组样本进行差异表达基因分析。我们利用GEO2R对所选的芯片进行差异表达基因筛选及数据下载，并将探针名称转化为标准基因名称。筛选标准为P<0.05和|log2FC|>1[差异表达倍数(fold change，FC)]。

1.2.2GO功能注释和KEGG信号通路富集分析将筛选出来的差异表达基因导入DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，依据GO(Gene Ontology)数据库，以人源基因为背景，对差异表达基因进行生物学功能注释。并利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路数据库进行信号通路的富集，寻找差异表达基因所富集的信号通路。

1.2.3蛋白相互作用网络构建及关键枢纽基因的筛选通过STRING 10.5数据库(http://string-db.org/)，以互作评分combination score>0.4为条件构建差异表达基因蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)，然后将数据导入Cytoscape软件，利用Cytoscape软件中的CytoHubba插件进行拓扑学分析，计算边缘渗透组件(edge percolated component，EPC) ，度值(Degree) 和最大邻域组件(maximum neighborhood component，MNC)以筛选出PPI网络中的重要节点，并根据节点度大小进行排序。最后，对EPC、Degree 和MNC分别筛选出的前10个重要节点取交集得出本研究的关键枢纽基因。

1.2.4关键枢纽基因RT-PCR验证人小梁网细胞购于上海拜力生物公司，小梁网细胞分为两组：实验组用含100 nmol/L地塞米松的DMEM培养基培养10d，对照组用不含地塞米松的DMEM培养液培养10d。用Trizol提取细胞RNA，Nanodrop测RNA浓度，使用Prime Script RT试剂盒合成cDNA，用SYBR Green Master Mix试剂盒对筛选出来的关键枢纽基因的表达量进行RT-PCR检测验证。使用ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达量。

2结果

2.1地塞米松处理的小梁网组织和正常小梁网组织之间的差异表达基因本研究选择的基因表达谱芯片GSE37474包括5对配对样本，地塞米松处理的小梁网组织的5个样本为实验组，无地塞米松处理的小梁网组织的5个样本为对照组。以P<0.05和|log2FC|>1作为标准筛选差异表达基因。与正常小梁网组织相比，地塞米松处理的小梁网组织有252个基因存在差异表达，其中141个为上调基因，111个为下调基因，见火山图(图1A)和差异基因聚类热图(图1B)。

图1 地塞米松处理的小梁网组织和正常小梁网组织之间的差异表达基因图 A：基因火山图；B:聚类热图。

2.2差异表达基因GO功能注释和KEGG信号通路富集分析252个差异表达基因GO功能注释结果显示(图2A), 差异表达基因主要定位于细胞外基质、细胞外区域、细胞外泌体、肌原纤维Z盘、细胞基底膜和细胞表面等细胞成分( cell component，CC)；主要参与炎症的正调控和细胞外基质重塑等生物学过程( biological processes，BP)；主要参与细胞因子活性、肝素结合和生长因子活性等分子功能( molecular function，MF)。KEGG信号通路富集分析结果显示(图2B)，差异表达基因主要参与血管平滑肌收缩、花生四烯酸代谢、醚脂质代谢和癌症胆碱代谢等相关信号通路。

图2 差异表达基因GO功能注释和KEGG信号通路富集分析 A：差异表达基因的GO 功能注释;B:KEGG 通路功能富集分析。

2.3PPI网络的构建及关键枢纽基因的筛选用STRING 10.5数据库和Cytoscape构建差异表达的基因之间蛋白质相互作用网络。去除游离的蛋白影响后，得到了由179个节点，443条边构成的网络(图3A)。用Cytoscape 软件中的CytoHubba插件对网络进行分析，基于EPC(边缘渗透组件)、Degree(度)和MNC(最大邻域组件)三种拓扑算法分别探索PPI网络中的前10个重要节点(图3B、C、D和表1)。将上述三种算法所获得结果取交集，得出7个重叠差异表达基因，即关键枢纽基因，其中包括3个上调基因EDN1、FOS、LPL和4个下调基因CCL2、IGF1、PTGS2、CCL5(图4和表2)。

表1 基于EPC和Degree及MNC算法分别得出的前10名基因

图3 差异表达基因的PPI网络及关键枢纽基因的筛选(红色代表上调基因，绿色代表下调基因) A：差异表达基因构建的PPI网络；B：EPC算法中排名前10名的基因；C：Degree算法中排名前10名的基因；D：MNC算法中排名前10名的基因。

表2 基于EPC和Degree及MNC算法中前10名基因的交集

2.4关键枢纽基因RT-PCR验证对筛选出来的7个关键枢纽基因(CCL2、IGF1、PTGS2、EDN1、FOS、CCL5、LPL)进行RT-PCR验证(相关引物见表3)。相比正常小梁网组织，地塞米松处理的小梁网细胞中CCL2(P=0.006)，IGF1(P=0.001)，PTGS2(P=0.003)和CCL5(P=0.017)的mRNA表达量下降，而EDN1 (P=0.018)，FOS(P=0.004)和LPL(P=0.023)的mRNA表达量上升，结果和基因表达谱芯片一致(图5)。

表3 关键枢纽基因RT-PCR引物序列

图4 EPC和Degree及MNC算法中前10名基因交集的韦恩图。

图5 关键枢纽基因的RT-PCR验证 aP<0.05, bP<0.01 vs 正常小梁网组织。

3讨论

GIG的发病机制被认为和开角型青光眼相似，但其具体发病机制目前仍不清楚，目前认为可能与GC引起的小梁网细胞外基质重塑有关[4-6]。GO功能注释结果提示，地塞米松引起的小梁网组织差异基因主要位于细胞外区域，参与细胞外基质重塑。这一结果表明，GC引起的小梁网变化主要发生在细胞外基质。KEGG通路分析显示差异基因主要参与血管平滑肌收缩、花生四烯酸代谢、醚脂质代谢和癌症胆碱代谢等相关信号通路。血管平滑肌细胞上存在GC受体，GC可诱导上调血管平滑肌细胞表达去甲肾上腺素和血管紧张素Ⅱ受体，引起血管收缩，使外周阻力增加，被认为是GC诱发高血压的机制之一[7-9]。但目前尚无文献报道GC引起的血管收缩是否在GIG的发病中起作用。KEGG分析提示差异基因还富集在脂质代谢过程，包括花生四烯酸代谢和醚脂质代谢，提示脂质代谢可能参与了GIG的发病。国外研究发现血脂水平升高和眼压水平增高呈正相关，且长期服用他汀类药物可以降低眼压[10-11]。国内亦有研究报道，血总胆固醇水平与原发性开角型青光眼和眼压具有相关性[12]。脂质代谢中花生四烯酸代谢和醚脂质代谢参与GIG发病的具体机制仍需进一步研究。另外，在开角型青光眼患者的房水中二酰基甘油磷酸胆碱和酰基甘油磷酸胆碱水平升高[13]。Leruez等[14]亦报道相对于正常人，开角型青光眼患者血浆中磷脂酰胆碱水平升高。结合KEGG通路富集结果，提示异常的胆碱代谢可能在GIG的病理生理学中起重要作用。

在最终确定的7个关键枢纽基因中，趋化因子(C-C基序)配体2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)在三种算法中都显示出最高的相关程度(得分最高)，且在地塞米松处理组表达下调。CCL2也被称为单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)，是促炎因子之一，可被内皮细胞，成纤维细胞和单核细胞等多种细胞分泌。正常的小梁网状内皮细胞在没有刺激的情况下会分泌大量的CCL2[15]。有研究表明，CCL2可通过改变Schlemm管内皮细胞间的接触来增加房水流出，从而降低眼压[16]。然而有研究报道，在开角型青光眼患者的房水中CCL2水平是升高的[17]。而本研究的结果提示CCL2在GIG中是下降的，这可能与GC可以下调CCL2的表达有关。CCL2在GC诱导的青光眼中的生理作用需要进一步研究。胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF1)在地塞米松处理组亦表现为下调，IGF1可由小梁网细胞表达，被认为可促进基质金属蛋白酶产生及减少细胞外基质的沉积，改善房水流出[18]。因此，IGF1的下调导致细胞外基质沉积可能是GIG的发病机制之一。但有报道称开角型青光眼患者房水中IGF1表现为上调[19]，IGF1在开角型青光眼中的升高可能是机体的负反馈调节。其他2个下调基因，前列腺素氧化环化酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)和趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)，在青光眼研究中并未见报道，其表达和功能仍值得研究。

在上调基因中，内皮素1(endothelin 1,EDN1)是另一个重要的枢纽基因。EDN1是目前最强的血管收缩肽，在调控血管舒缩、细胞增殖、分化等方面发挥重要作用。同时，EDN1还具有强大的促纤维化作用，通过多种途径促进成纤维细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞等合成细胞外基质，并干扰组织中基质金属蛋白酶的活性，导致细胞外基质蓄积。EDN1通过活化Rho激酶来调节多种细胞骨架相关蛋白的磷酸化，从而介导细胞骨架的重构。在眼部，房水流出通道上小梁网和Schlemm管中含有丰富EDN1及其受体。非色素性睫状上皮细胞可能是眼组织中EDN1产生的一种来源[20]。在原发性开角型青光眼、正常眼压青光眼，色素剥脱综合症患者和青光眼动物模型房水中，EDN1的水平比正常明显升高，因此认为其与青光眼发病密切相关[21]。GC可刺激EDN1的表达[22]，因此在GIG中，GC可能通过上调EDN1从而导致小梁网细胞外基质增加和/或改变小梁细胞骨架和细胞形态，引起房水流出阻力增加，最后导致眼压增高。

综上，通过生物信息学分析，我们认为地塞米松引起的人小梁网病理改变主要在细胞外基质，引起的通路改变主要集中在血管平滑肌收缩、花生四烯酸代谢、醚脂质代谢和胆碱代谢，筛选出的7个关键枢纽基因中，有3个基因被报道与房水调节有关，包括2个下调基因(CCL2和IGF1)和一个上调基因(EDN1)，这3个基因在GIG的发病机制中可能起着重要作用。其他2个下调基因(PTGS2和CCL5)和2个上调基因(FOS和LPL)，在青光眼研究中并未见报道，其在青光眼中的作用仍值得探索。