响应面优化紫苏饼粕蛋白提取工艺

张品，朱文秀，余顺波，陈大伦，李风华，郭晋红

贵州省农业科学院油菜研究所（贵阳 550018）

紫苏（Perilla frutescens）作为我国传统的药食两用植物资源，越来越受到人们的重视，近年来其开发利用已成为研究热点[1-6]。紫苏饼粕是紫苏籽油加工过程中的副产物，其气味芬芳，适口性好，蛋白质含量20%～25%，含18种氨基酸且富含人体所必需的8种氨基酸[7-14]，是一种优良的植物蛋白资源。目前，紫苏饼粕主要是作为饲料或肥料还田，在一定程度上污染环境，造成优质蛋白质的浪费[15-18]。随着紫苏的大面积种植和紫苏籽油的开发利用，如何有效、充分、合理利用优质紫苏饼粕，研究开发蛋白产品成为目前亟待解决的问题。碱溶酸沉法是利用蛋白质在碱液中溶解、等电点沉淀的这一特性，该方法提取条件温和，蛋白质不易变质，工艺流程简单，生产成本低，易于实现工业化应用[19-20]。试验以脱脂紫苏饼粕为原料，采取碱溶酸沉法提取紫苏饼粕蛋白。在单因素试验基础上，采用响应面优化结合Box-Behnken设计试验对提取工艺条件进行优化，确定最佳提取工艺条件，以期为紫苏蛋白资源的开发利用提供理论指导和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏饼粕（贵州油研纯香生态粮油科技有限公司）；Bradford蛋白质定量试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；石油醚（沸程30～60 ℃）；氢氧化钠、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸（均为分析纯，阿拉丁）。

1.2 仪器与设备

SHA-2l冷冻水浴全温摇床（常州市瑞华仪器制造有限公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；FE20型实验室pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；L-550台式低速大容量离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 方法

1.3.1 紫苏饼粕蛋白提取工艺流程

紫苏饼粕→脱脂→加水→调节pH→加热提取→离心→收集上清液→调节pH至等电点→离心→收集沉淀物→真空低温干燥→粉碎，过筛→粗提紫苏饼粕蛋白

1.3.2 试验方法

1.3.2.1 基本组成成分的测定

水分，采用GB/T 10358—2008[21]的恒重法测定；粗脂肪，采用GB/T 6433—2006[22]的索氏抽提法测定；粗蛋白，采用GB 5009.5—2016[23]的凯氏定氮法测定；灰分，采用GB 5009.4—2016[24]的灼烧重量法测定；可溶性蛋白质，采用考马斯亮蓝法（Bradford法）测定。

1.3.2.2 紫苏饼粕蛋白等电点的测定

紫苏饼粕蛋白等电点的测定采用溶解性法。用10%氢氧化钠溶液和15%盐酸溶液调节pH，在pH 3.0～ 5.6范围内设14个点，确定紫苏饼粕蛋白的等电点。

1.3.3 单因素试验设计

试验以蛋白提取率为指标，考察饼粕颗粒大小、料液比、碱提pH、碱提温度、碱提时间和搅拌速度对蛋白提取率的影响。采用Bradford法测定碱提离心后上清液中蛋白质浓度，提取率按式（1）计算。

1.3.4 Box-Behnken试验设计

以蛋白提取率为响应值，采用响应面中心组合试验设计，研究各参数对考察指标的影响规律，各因素水平编码见表1。

表1 响应面试验因子水平及编码

1.3.5 数据处理

每次试验均进行3次重复操作。采用SPSS 16.0数据分析软件进行显著性分析。使用Excel 2010软件对数据进行统计分析并绘制图表，使用Design Expert 8.0.6进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 基本组成成分分析

紫苏饼粕和脱脂紫苏饼粕的基本组成成分如表2所示（蛋白质系数以6.25计）。从表2可以看出，紫苏饼粕的粗蛋白含量30.33%，脱脂后含量更高，达36.68%，是分离提取蛋白质的良好植物蛋白资源。

表2 紫苏籽、紫苏饼粕和脱脂紫苏饼粕基本组成成分表 单位：%

2.2 紫苏饼粕蛋白等电点的测定

pH与盐酸调节后上清液蛋白质浓度关系如图1所示。上清液中蛋白质的浓度随着pH增加先降低后增加。在pH 4.2～4.6，上清液中蛋白质浓度较低；pH 4.4时，上清液中蛋白质浓度最低，只有203.753 3 μg/mL，说明pH 4.4时溶液中的大部分蛋白质已经沉淀，紫苏饼粕蛋白的溶解度最小，基于此判断紫苏饼粕蛋白的等电点（PI）在4.4左右，这与朱国君[20]报道结果吻合。试验选择pH 4.4作为紫苏饼粕蛋白分离提取工艺酸沉淀的最适pH。

图1 紫苏饼粕蛋白等电点的测定结果

2.3 单因素试验结果与分析

2.3.1 饼粕颗粒大小对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

饼粕颗粒越小，越有利于碱提液穿透饼粕接触到蛋白分子，越有利于蛋白的溶出。由图2可见，颗粒大小对紫苏饼粕蛋白提取率的影响并不明显。颗粒大小＞0.25 mm，蛋白提取率为16.68%；随着颗粒大小的降低，蛋白提取率提高不显著。故试验选取颗粒大小＜0.25 mm的脱脂紫苏饼粕为原料。

图2 饼粕颗粒大小对蛋白提取率的影响

2.3.2 料液比对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

不同料液比对紫苏饼粕蛋白提取率的影响见图3。提取液的多少对紫苏饼粕蛋白提取率有显著的影响，是由于碱提过程中料液比的多少，会影响蛋白在提取液中的溶解。料液比从1∶5（g/mL）增加至1∶20（g/mL），蛋白提取率从13.77%提高到28.95%；料液比从1∶20（g/mL）增加至1∶25（g/mL），蛋白提取率从28.95%提高到30.57%，增幅有所下降；料液比从1∶25（g/mL）增加至1∶30（g/mL），蛋白提取率从30.57%提高到31.33%，无显著差异。因此选取料液比1∶25（g/mL）进行紫苏饼粕蛋白的提取优化试验。

图3 料液比对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

2.3.3 碱提pH对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

试验选取碱提pH 6～11考察其对紫苏饼粕蛋白提取率的影响。由图4可以看出，紫苏饼粕蛋白提取率随碱提pH变化而发生显著变化，是因为碱提pH的变化能够改变蛋白质的带电情况，直接影响到蛋白质-蛋白质、蛋白质-水的相互作用，使蛋白质的溶解度发生明显变化。pH 6时，碱提液接近中性，蛋白质-蛋白质之间的作用较强，蛋白提取率比较低，只有5.87%；随着pH增加，蛋白质-蛋白质的相互作用减弱，蛋白质-水之间的作用增强，导致蛋白提取率增加。达到pH 9后，蛋白提取率的升高趋势变缓慢。强碱性可能会导致蛋白的变性从而使其丧失利用价值，故选取碱提pH 8～10进行紫苏饼粕蛋白的提取优化试验。

图4 碱提pH对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

2.3.4 碱提温度对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

因为蛋白质在不同的温度下溶解度不同，试验选取碱提温度30～70 ℃考察其对紫苏饼粕蛋白提取率的影响。由图5可以看出，随着碱提温度改变，紫苏饼粕蛋白提取率变化显著。温度从30 ℃升高至60 ℃，蛋白提取率从13.73%提高到20.46%，温度越高，蛋白质的溶解度越高，蛋白提取率越高。温度升高至70 ℃，蛋白提取率略有降低，可能是因为高温导致的淀粉糊化、蛋白质变性等影响蛋白质的溶解度，进而影响蛋白提取率。故选取碱提温度40～60 ℃进行紫苏饼粕蛋白的提取优化试验。

图5 碱提温度对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

2.3.5 碱提时间对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

试验选取碱提时间30～150 min考察其对紫苏饼粕蛋白提取率的影响。由图6可以看出，随着碱提时间的延长，紫苏饼粕蛋白提取率随之增加。碱提时间从30 min延长至120 min，蛋白提取率从13.07%提高到26.22%；碱提时间超过120 min后蛋白提取率提高不明显。这可能是由于碱提液需要一定的时间穿透饼粕颗粒，使蛋白质逐步水化与溶解；到达一定碱提时间后，所有蛋白质基本水化溶出，提取率变化缓慢，甚至没有变化。因此选取碱提时间60～120 min进行紫苏饼粕蛋白的提取优化试验。

图6 碱提时间对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

2.3.6 搅拌速度对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

搅拌速度对紫苏饼粕蛋白提取率的影响如图7所示。搅拌速度从50 r/min增加至150 r/min，蛋白提取率从15.38%提高到20.82%；搅拌速度超过150 r/min后蛋白提取率基本保持不变。提取过程中搅拌可以帮助碱提液更快地穿透饼粕颗粒接触到蛋白分子。但是当搅拌速度达到一定程度后，蛋白溶出达到平衡，蛋白提取率保持不变。因此选取搅拌速度150 r/min进行紫苏饼粕蛋白的提取优化试验。

图7 搅拌速度对紫苏饼粕蛋白提取率的影响

2.4 响应面试验结果与分析

2.4.1 模型建立与数据分析

基于单因素试验分析，根据Box-Behnken中心组合设计三因子三水平的响应面分析试验，试验数据列于表3。

表3 响应面试验设计及结果

利用Design Expert软件对试验数据进行多元回归拟合，得到以蛋白提取率（Y）为响应值的三元二次回归模型方程：蛋白提取率（Y）=26.658+1.763 75A+ 2.831 25B+1.575C-1.722 5AB-2.05AC-1.215BC- 5.240 25A2-3.470 25B2-0.132 25C2。

回归模型方差分析见表4。由表4可知，所建立的蛋白提取率回归模型F值为33.54，p值小于0.000 1，表明模型与试验数据非常吻合。R2=0.977 3，表明只有2.27%的变异不能被模型解释，说明模型能够较好反映响应值的变化。失拟项F值为1.74，p值为0.297 6不显著，说明回归模型和预测值之间有较好拟合度。变异系数较低（4.54%），表明所做的试验具有较高的准确性和可靠性。模型的一次项A、B、C（p＜ 0.01）影响均极显著；二次项A2、B2（p＜0.01）影响极显著，C2（p＞0.05）影响不显著；交互项AC（p＜ 0.01）影响极显著，AB、BC（p＜0.05）影响显著；由A、B、C的F值可知3个因素对蛋白提取率影响的顺序为B＞A＞C，即碱提温度＞碱提pH＞碱提时间。

2.4.2 响应面交互分析

为直观反映各因素及其交互作用对蛋白提取率的影响结果，对回归方程绘制三维响应面图，见图8。碱提pH与碱提温度交互曲面陡峭，表明二者对蛋白提取率的交互作用明显，碱提时间与碱提pH、碱提温度交互曲面比较平缓，表明二者对蛋白提取率交互作用不明显。

图8 各因素交互作用对蛋白提取率影响的响应面曲线图

2.4.3 验证试验

以蛋白提取率为指标，由响应面软件优化的紫苏饼粕蛋白提取工艺条件为碱提pH 8.932，碱提温度52.5 ℃，碱提时间120 min。该条件下蛋白提取率为28.576 9%。综合考虑，调整提取工艺参数为碱提pH 8.9，碱提温度53 ℃，碱提时间120 min。采取该最佳条件进行紫苏饼粕蛋白提取，所得的提取率为29.765 2%，与理论值无显著差异，表明可利用此模型对紫苏饼粕蛋白提取工艺条件进行响应面优化。

2.5 产品指标

按照试验所得工艺条件对紫苏饼粕进行碱溶酸沉，离心，低温干燥后所得紫苏饼粕蛋白产品呈淡黄色，带有紫苏特有的香气；其水分5.26%、灰分2.93%、粗脂肪0.68%、粗蛋白（蛋白纯度）85.36%。

3 结论

通过单因素试验、响应面试验和验证试验确定紫苏饼粕蛋白提取最优工艺参数：饼粕颗粒大小＜0.25 mm，料液比1∶25（g/mL），碱提pH 8.9，碱提温度53 ℃，碱提时间120 min，搅拌速度150 r/min。在此最优工艺参数下蛋白提取率为29.765 2%，蛋白纯度为85.36%，产品具有紫苏独特的清香。